Sistema de selección que contiene un marcador de selección que no es de resistencia a antibióticos.

Un sistema de selección libre de antibióticos que comprende una célula bacteriana carente de un gen araD

, en el que un vector que porta un gen araD ha sido añadido como marcador de selección, en donde a partir de dicho gen araD de dicho vector se expresa una L-ribulosa-5-fosfato 4-epimerasa activa.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/FI2004/000540.

Solicitante: FIT BIOTECH OY.

Nacionalidad solicitante: Finlandia.

Dirección: Biokatu 8 33520 Tampere FINLANDIA.

Inventor/es: USTAV,MART, TOOTS,URVE, MANNIK,ANDRES, TENSON,TANEL, LAHT,SILJA, ADOJAAN,MAARJA.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/61 (Isomerasas (5))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones... > C12N9/90 (Isomerasas (5.))

PDF original: ES-2529346_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Sistema de selección que contiene un marcador de selección que no es de resistencia a antibióticos Campo de la invención

La presente invención se refiere a un nuevo sistema de selección, que se basa en el uso de un gen araD o una forma mutada de un gen araD introduciendo un Codón de parada en el Codón 8 del gen araD como marcador de selección y al uso de una cepa bacteriana carente del gen araD. La presente invención se refiere adicionalmente a nuevos vectores que contienen un gen araD, una forma mutada de un gen araD introduciendo de Codón de parada en el Codón 8 del gen araD, en donde a partir de dicho gen araD de dicho vector se expresa una L-ribulosa-5-fosfato 4-epimerasa activa y a nuevas cepas bacterianas carentes de un gen araD. La presente invención se refiere adicionalmente a un método de selección de las células transformadas con un plásmido, que contiene el gen de interés.

Antecedentes de la invención

Un requisito esencial para la modificación genética eficaz de bacterias y otras células propagadas en cultivos celulares es la capacidad para seleccionar las células con una alteración genotípica específica. La estrategia de selección más común en la tecnología del ADN recomblnante es Incluir un marcador de selección en el vector de clonación o plásmido. Un marcador de selección puede ser un gen clonado o una secuencia de ADN, que permite la separación de las células anfitrionas que contienen el marcador de selección de las que no lo contiene. El marcador de selección junto con un medio de selección adecuado mantiene el vector de clonación en las células. Por otra parte, puesto que la replicación de los plásmidos es una carga energética para el anfitrión bacteriano, en un medio de cultivo las bacterias, que han perdido el plásmido, tendrían una ventaja de crecimiento sobre las células con el plásmido.

Para la mayoría de los propósitos, un gen de resistencia a antibióticos es un marcador de selección comúnmente utilizado. Sin embargo, para la producción de agentes terapéuticos recombinantes, donde el objetivo es generar un producto, tal como una vacuna de ADN, con un alto rendimiento para su administración a pacientes, el uso de genes de resistencia a antibióticos presenta problemas: la propagación de patógenos resistentes a los antibióticos es un grave problema mundial [Levy, S. B., J. Antimicrob. Chemother. 49 (22) 25-3]. Por lo tanto los genes de resistencia a antibióticos no pueden tener un amplio uso en la industria farmacéutica, y, por ejemplo, de acuerdo con las regulaciones de la Administración de Alimentos y Fármacos de los Estados Unidos, no están permitidos genes de resistencia a antibióticos en las vacunas de ADN experimentales que entran en la tercera fase.

Alternativamente, se han sugerido sistemas de selección libres de antibióticos. Tales sistemas de selección libres de antibióticos incluyen sistemas bacterianos de toxina-antitoxina [Engelberg-Kulka, H. y Glaser, G., Annu Rev Microbiol 53 (1999) 43-7], genes responsables de la resistencia contra metales pesados, tales como el teluro [Silver, S. y Phung, L. T., Annu Rev Microbiol 5 (1996) 753-789], y sistemas en los que el plásmido codifica un gen que complementa una auxotrofla del anfitrión [Wang, M. D., et al., J. Bacteriol. 169 (1987) 561-5614].

La Solicitud de Patente de los Estados Unidos Núm. 2/14476 A1 describe generalmente, entre otras cosas, el uso de un marcador de selección distinto de antibiótico, que puede ser un gen cuyo producto es necesario para el metabolismo de la célula bajo ciertas condiciones de cultivo, tal como un gen de catabolismo, lo que hace posible que la célula asimile una cierta sustancia presente en el medio de cultivo (fuente de carbono o nitrógeno específica) etc. No se proporcionan ejemplos específicos de tales genes adecuados. Este enfoque no es necesariamente aplicable a la producción comercial, ya que la eliminación de un componente esencial, tal como un aminoácido o una fuente de carbono, del medio de crecimiento reduce el rendimiento, lo cual no es deseable. Además, la manipulación del medio de crecimiento en términos de omisión de un nutriente esencial puede aumentar considerablemente el coste del medio de crecimiento, ya que las mezclas nutrientes disponibles comercialmente deben ser reemplazadas por nutrientes individuales.

Se ha construido un sistema de selección eficaz sobre la base de los genes araD/araC [Ariza, R. R., et al., Carcinogenesis 14 (1993) 33-35], Sin embargo, este sistema de selección se ha utilizado en los estudios sobre los mecanismos de mutagénesls pero no se ha utilizado antes como marcador de selección para el mantenimiento del plásmido. Ariza et al. utilizaron una cepa donde el gen araC contiene un codón de terminación y el gen araD está inactivado. Se introdujo en el plásmido un producto del gen supF, que codifica un supresor de ARNt. En presencia de ARNt supresor activo, se produjo el producto enzimátlcamente activo a partir de araC causando la detención del crecimiento celular (puesto que araD era inactivo). Este sistema permite estudiar la supresión de mutaciones por ARNt de supF: en el caso de que supF sea inactivado por mutación, las células pueden crecer sobre arabinosa. Por lo tanto, este sistema de selección se basa en el gen araC y no en el gen araD. araD no se introdujo en un plásmido, ni el sistema se diseñó o caracterizó para fines de producción del plásmido.

Para fines terapéuticos comerciales sería ventajoso utilizar un gen, que no fuera esencial para el crecimiento del anfitrión, pero cuya manipulación aún afecte al crecimiento en circunstancias seleccionadas. Además, en vista del

uso terapéutico, sería ventajoso utilizar un gen, cuya deleción conduzca a la acumulación de compuestos, que son tóxicos para la célula anfitrlona pero no tóxicos para los mamíferos, incluyendo seres humanos. También serla ventajoso utilizar genes más pequeños, lo que a su vez permitirla la construcción de plásmidos más pequeños para los cuales el consumo de energía para la replicación serla menor y por lo tanto se mejorarían la tasa de crecimiento de cultivo bacteriano y el rendimiento de plásmidos.

Breve descripción de la invención

El objeto de la presente invención es proporcionar un nuevo sistema de selección libre de antibióticos, que evita los problemas de los sistemas de selección previamente descritos para su uso en la producción de productos terapéuticos recombinantes.

Otro objeto de la invención es proporcionar un nuevo sistema de selección libre de antibióticos, que se puede utilizar de forma segura en la producción de productos terapéuticos recombinantes en términos del medio ambiente y la seguridad del paciente.

Un objeto adicional de la invención es proporcionar un nuevo sistema de selección libre de antibióticos, que se puede utilizar rentablemente en la producción de productos terapéuticos recombinantes utilizando medios de crecimiento convencionales.

Un objeto adicional más de la invención es proporcionar un nuevo sistema de selección libre de antibióticos, que proporciona un aumento de la tasa de crecimiento y rendimiento mejorado.

Otro objeto adicional de la presente invención es proporcionar un vector novedoso que contiene un marcador de selección, que es no tóxico para el medio ambiente y para los seres humanos y que es capaz de un mantenimiento a largo plazo en el anfitrión.

Otro objeto adicional de la presente invención es proporcionar una nueva célula anfitriona que contiene un defecto génico, que no es peligrosa para el medio ambiente.

Otro objeto más de la presente invención es proporcionar un método para la selección de células que portan un gen de interés para la producción de productos terapéuticos... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un sistema de selección libre de antibióticos que comprende una célula bacteriana carente de un gen araD, en el que un vector que porta un gen araD ha sido añadido como marcador de selección, en donde a partir de dicho gen araD de dicho vector se expresa una L-ribulosa-5-fosfato 4-epimerasa activa.

2. Un sistema de selección libre de antibióticos de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la célula bacteriana es una célula de Escherichia coli.

3. Un sistema de selección libre de antibióticos de acuerdo con la reivindicación 2, en donde una mutación en el gen araD del vector introduce un codón de parada en el codón 8 del gen araD, en donde a partir de dicho gen araD de dicho vector se expresa una L-ribulosa-5-fosfato 4-epimerasa activa.

4. Un sistema de selección libre de antibióticos de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la £ coli es una cepa de £ coli JM19.

5. Un sistema de selección libre de antibióticos de acuerdo con la reivindicación 2 o 3, en donde la £ coli es una cepa de £ coli DH5 alfa-T1.

6. Un sistema de selección libre de antibióticos de acuerdo con la reivindicación 2 o 3, en donde la £ coli es una cepa de £ coli AG1.

7. Un sistema de selección libre de antibióticos de acuerdo con la reivindicación 2, en donde dicha cepa de £ coli es la cepa DH5 alfa-T1 carente del gen araD y del gen ulaF.

8. Un sistema de selección libre de antibióticos de acuerdo con la reivindicación 2, en donde dicha cepa de £ coli es la cepa AG1 carente del gen araD y del gen sgbE.

9. Un sistema de selección libre de antibióticos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5-6, en donde dicha cepa de £ coli carece del gen araD, del gen ulaF, y del gen sgbE.

1. Un vector que comprende una araD gen con una mutación que genera un codón de parada en el codón 8 del gen araD como marcador de selección.

11. Un vector de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el vector es un vector de expresión que comprende:

(a) una secuencia de ADN que codifica una proteína de anclaje nuclear ligada operativamente a un promotor heterólogo, comprendiendo dicha proteína de anclaje nuclear

(i) un dominio de unión a ADN que se une a una secuencia de ADN específica, y

(¡i) un dominio funcional que se une a un componente nuclear, o un equivalente funcional del mismo; y

(b) una secuencia de ADN multimerizada que forma un sitio de unión para la proteína de anclaje nuclear, en donde dicho vector carece de un origen de la repllcación del virus del papiloma.

12. Un vector de acuerdo con la reivindicación 11, en donde

(a) la proteína de anclaje nuclear es la proteína E2 del virus del papiloma bovino tipo 1 (BPV), y

(b) la secuencia de ADN multimerizada son múltiples sitios de unión para la proteína E2 de BPV incorporada al vector como agrupación, donde los sitios pueden ser estructuras de cabeza a cola o pueden estar incluidos en el vector mediante posicionamiento espaciado, en donde dicho vector carece de un origen de replicación del virus del papiloma.

13. Un vector de acuerdo con la reivindicación 12, que comprende adicionalmente una deleclón en la secuencia de ADN multimerizada.

14. Un vector de acuerdo con la reivindicación 12, que comprende adicionalmente una mutación en la secuencia de Shine-Dalgarno del gen araD.

15. Un método de selección de células transformadas con un plásmido que contiene un gen araD como marcador de selección y el gen de interés, comprendiendo el método insertar el plásmido en la célula anfitrlona carente de araD y hacer crecer las células en un medio de crecimiento que contiene arabinosa, en donde a partir de dicho gen araD de dicho plásmido se expresa una L-ribulosa-5-fosfato 4-epimerasa activa.

16. Un método de acuerdo con la reivindicación 15, en donde la célula es una célula de Escherichia coli.

17. Un método de acuerdo con la reivindicación 16, en donde el gen araD del plásmido se muta generando un codón de parada en el codón 8 del gen araD, en donde a partir de dicho gen araD de dicho plásmido se expresa

una L-ribulosa-5-fosfato 4-epimerasa activa.