Dispositivo para detectar urea en una muestra, que comprende: (a) un sensor con el que puede ponerse en contacto una muestra que se sospecha que contiene urea,

incluyendo el sensor ureasa y anhidrasa carbónica inmovilizadas sobre al menos una parte de un único electrodo de dicho sensor, y (b) un sistema detector para procesar señales desde el sensor, en el que el dispositivo está configurado para inhibir el intercambio de gases desde la muestra hacia un espacio de aire en una zona de la ureasa y la anhidrasa carbónica inmovilizadas

I. Campo de la invención

Un aparato y un método para la rápida determinación in situ de urea en muestras líquidas que puede usarse en el campo de diagnóstico clínico inmediato, incluyendo su uso en lugares de accidente, salas de urgencia, en cirugía, en unidades de cuidados intensivos, y también en entornos no médicos.

II. Antecedentes de la invención

La invención se refiere a un aparato y a su método de uso para determinar la presencia o la concentración de urea en una muestra líquida, por ejemplo en dispositivos de autoanálisis de laboratorio y preferiblemente en cartuchos desechables de único uso adaptados para realizar diversos ensayos de analitos casi en tiempo real o en tiempo real.

En realizaciones específicas, la invención se refiere a la determinación de urea en muestras biológicas tales como sangre, componentes sanguíneos y orina.

Las técnicas de microfabricación (por ejemplo, fotolitografía y deposición de plasma) son atractivas para la construcción de estructuras de sensor de múltiples capas en espacios confinados. En la patente estadounidense

5.200.051 concedida a Cozzette et al., que se incorpora al presente documento como referencia en su totalidad se dan a conocer métodos para la microfabricación de sensores de BUN (nitrógeno ureico en sangre), por ejemplo sobre sustratos de silicio. El sensor comprende un chip de silicio con un electrodo de plata / cloruro de plata sobre el que se encuentra una capa de poli(cloruro de vinilo) plastificada que contiene el ionóforo de amonio, nonactina. Sobre esta capa se encuentra una capa de un material de látex de formación de película que contiene ureasa. Ionóforos de amonio alternativos incluyen gramicidina D (Nikolelis y Siontorou; Ammonium ion minisensors form selfassembled bilayer, Anal. Chem. 68, 1735, 1996) y péptidos bicíclicos (Nowak; Design, synthesis and evaluation of bicyclic peptides as ammonium ionophores; Thesis, Worcester Politechnic Institute, 2003).

El dispositivo de Cozzette et al., funciona de la manera potenciométrica convencional, en la que la enzima ureasa convierte la urea de la muestra en iones amonio, estos iones se detectan por la membrana selectiva de amonio que recubre el electrodo. El potencial eléctrico en el electrodo es una función logarítmica de la concentración de amonio y por tanto de la concentración de urea en masa. Mediante la calibración del sensor con patrones conocidos que contienen urea, puede estimarse la concentración de urea en la muestra.

Se ha usado la enzima anhidrasa carbónica (CA) en un sensor de dióxido de carbono (pCO2), que se añadió a la capa de electrolito para acelerar el equilibrio CO2/H2CO3 acuoso. Este uso de CA es muy conocido y no está relacionado con la detección de urea, véase: Lindskog, S., Henderson, L., Kannan, K., Liljas, A., Nyman, P., y Strandberg, B.: Carbonic Anhydrase, The Enzymes 5, 587, 1971.

Botre, C. y Botre, F., (“Carbonic Anhydrase and Urease: An Investigation In Vitro on the Possibility of Synergic Action,”) Biochimica et Biophysica Acta, 997, 111-4, (1989), apoyan la existencia de una conexión fisiológica entre los niveles in vivo de urea y la producción de la actividad enzimática de CA. Botre enseña la colocación de un electrodo de detección de gas de amonio, un electrodo de detección de gas de dióxido de carbono, y un sensor de pH en el interior de una disolución que contiene o bien ureasa, o bien ureasa y anhidrasa carbónica. También enseña la adición de urea y un inhibidor de CA (acetazolamida) a las disoluciones. Estos experimentos son compatibles con predicciones basadas en la ley de acción de masas, que se basan en que la presencia de anhidrasa carbónica puede influir (aumentar) en la tasa de hidrólisis de la urea por la ureasa, puesto que la CA elimina eficazmente el dióxido de carbono del sistema llevándolo a la fase gaseosa.

Específicamente, el bicarbonato formado por la reacción de la ureasa se convierte en dióxido de carbono por la CA, que luego se difunde fuera de la fase líquida y al aire. Este proceso tiene el efecto de reducir la reacción inversa en la que los iones amonio más el bicarbonato se convierten en urea. Por tanto, el efecto neto de la presencia de CA en este sistema es aumentar la tasa de producción de iones amonio.

Con respecto a la ley de acción de masas, es muy conocido en la técnica de reacciones enzimáticas reversibles, de manera genérica A = B + C, añadir un reactivo D que reacciona con C, para el fin de activar la reacción reversible en el sentido de B (A. W. Adamson, A Textbook of Physical Chemistry, Academic Press (Nueva York) 1973, capítulo 7.). Aunque la presente invención también busca usar anhidrasa carbónica para influir en la reactividad de la ureasa (UR), Botre no sugiere la presente invención por al menos las siguientes razones:

Botre no menciona la determinación analítica de la concentración de urea en una muestra, y no menciona la determinación analítica de urea en muestras biológicas de interés clínico, por ejemplo una muestra de sangre. Botre tampoco menciona la inmovilización de UR y CA, ni los electrodos potenciométricos con enzimas inmovilizadas.

Botre no menciona la microfabricación de electrodos potenciométricos para determinar cualquier analito que incluya urea, ni el uso de las enzimas UR y CA en un sistema que no permita que el intercambio de dióxido de carbono desde la disolución hacia un espacio de aire, como en un cartucho del documento US 5.096.669 que se incorpora al presente documento como referencia en su totalidad y otros sistemas analíticos en los que la urea se mide electroquímicamente.

El concepto de medición electroquímica diferencial por ejemplo potentiométrica y amperométrica, es muy conocido en la técnica electroquímica, véase por ejemplo Cozzette, documento US 5.112.455 y Cozzette, documento US 5.063.081, que se incorporan ambos al presente documento como referencia en su totalidad.

El documento US 5.081.063 da a conocer el uso de capas permeoselectivas para sensores electroquímicos y el uso de látex de formación de película para la inmovilización de moléculas bioactivas, que se incorpora al presente documento como referencia. El uso de poli(alcohol vinílico) (PVA) en la fabricación del sensor se describe en el documento US 6.030.827 que se incorpora como referencia. Los documentos US 6.030.827 y 6.379.883 enseñan métodos para estampar capas de poli(alcohol vinílico) y se incorporan como referencia en su totalidad.

Botre et al; Analytical Letters, vol. 22, n.º 11-12, 1989, páginas 2413-2422 describen un electrodo en el que la ureasa se proporciona sobre un elemento de triacetato de celulosa que luego se fija a un electrodo de pNH3 para proporcionar un sensor de urea. Botre et al. se centran en una interacción indirecta entre la anhidrasa carbónica y la ureasa en disolución.

La electroforesis en gel de una preparación de ureasa comercial típica, tal como se muestra en la figura 14, indica que los sensores de BUN de la técnica anterior no habrían incluido anhidrasa carbónica como impureza significativa.

III. Sumario de la invención

Un objeto de la invención es proporcionar un dispositivo para detectar urea en una muestra, que comprende: (a) un sensor con el que puede ponerse en contacto una muestra que se sospecha que contiene urea, incluyendo el sensor ureasa y anhidrasa carbónica inmovilizadas sobre al menos una parte de dicho sensor, y (b) un sistema detector para procesar señales desde el sensor, en el que el dispositivo está configurado para inhibir el intercambio de gases desde la muestra hacia un espacio de aire en una zona de la ureasa y la anhidrasa carbónica inmovilizadas.

Otro objeto es proporcionar una membrana de sensor que comprende: una matriz permeable al agua, que incluye al menos dos enzimas, ureasa y anhidrasa carbónica estando configurada la membrana en un dispositivo de manera que inhibe el intercambio de gases desde una muestra hacia un espacio de aire en una zona de la membrana. Asimismo en la presente invención se incluye el uso de una membrana tal como se describe en el presente documento en un dispositivo de detección de urea.

Además en la presente invención se incluye un dispositivo para detectar urea en una muestra, que comprende: un electrodo recubierto con una primera capa, comprendiendo dicha primera capa poli(cloruro de vinilo) plastificado y nonactina, y al menos dos enzimas, ureasa y anhidrasa carbónica, inmovilizadas sobre dicha primera capa.

1. Dispositivo para detectar urea en una muestra, que comprende: (a) un sensor con el que puede ponerse en contacto una muestra que se sospecha que contiene urea, incluyendo el sensor ureasa y anhidrasa carbónica inmovilizadas sobre al menos una parte de un único electrodo de dicho sensor, y (b) un sistema detector para procesar señales desde el sensor, en el que el dispositivo está configurado para inhibir el intercambio de gases desde la muestra hacia un espacio de aire en una zona de la ureasa y la anhidrasa carbónica inmovilizadas.

2. Dispositivo según la reivindicación 1, en el que dicho sensor comprende un sensor selectivo de iones amonio.

3. Dispositivo según la reivindicación 2, en el que el sensor selectivo de iones amonio incluye uno o más de los siguientes:

(a) un ionóforo de amonio;

(b) nonactina; o

(c) polímero plastificado.

4. Dispositivo según la reivindicación 1, en el que dicho sensor comprende uno o más de los siguientes:

(a) un sensor de pH;

(b) un sensor de dióxido de carbono o bicarbonato, y

(c) un sensor de conductividad.

5. Dispositivo según cualquier reivindicación anterior, que comprende además un segundo sensor sin dichas enzimas inmovilizadas.

6. Dispositivo según la reivindicación 5, en el que el sensor y el segundo sensor se seleccionan independientemente de un electrodo potenciométrico, un electrodo conductimétrico, un sensor óptico y combinaciones de los mismos.

7. Dispositivo según cualquier reivindicación anterior, en el que el sensor comprende un electrodo potenciométrico selectivo de iones amonio.

8. Dispositivo según cualquier reivindicación anterior, en el que la ureasa y la anhidrasa carbónica están inmovilizadas en una capa, comprendiendo dicha capa una matriz permeable al agua.

9. Dispositivo según la reivindicación 8, en el que la matriz permeable al agua comprende un látex de formación de película.

10. Dispositivo según la reivindicación 9, en el que dicho látex de formación de película comprende un copolímero de etileno y acetato de vinilo.

11. Dispositivo según cualquier reivindicación anterior, en el que al menos una de las enzimas está inmovilizada a través de un reactivo químico de reticulación, y/o a través de absorción física.

12. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en el que la capa comprende además un tampón.

13. Dispositivo según la reivindicación 12, en el que dicho tampón se selecciona de fosfato, TRIS, HEPES, y combinaciones de los mismos.

14. Dispositivo según las reivindicaciones 9 a 11, en el que dicho látex de formación de película incluye un tampón seleccionado del fosfato, TRIS, HEPES, y combinaciones de los mismos.

15. Membrana que comprende una matriz permeable al agua en la que están incluidas al menos dos enzimas, ureasa y anhidrasa carbónica, estando configurada la membrana en un dispositivo de manera que inhibe el intercambio de gases desde una muestra hacia un espacio de aire en una zona de la membrana.

16. Membrana según la reivindicación 15, en la que dichas al menos dos enzimas están inmovilizadas en dicha matriz permeable al agua.

17. Membrana según la reivindicación 15 o la reivindicación 16, que está en contacto físico con un electrodo selectivo de iones, y/o con un detector.

18. Membrana según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, que está unida físicamente a un electrodo selectivo de iones por medio de una junta tórica.

19. Membrana según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, que está unida a un elemento de sujeción que puede acoplarse a un electrodo selectivo de iones.

20. Membrana según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, que se forma aplicando una mezcla líquida sobre una superficie y permitiendo que dicha mezcla líquida se seque sobre dicha superficie.

21. Membrana según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20, que comprende un polímero seleccionado de acetato de celulosa, nitrocelulosa, poliuretano, albúmina sérica bovina reticulada mediante glutaraldehído, acrilamida, celofán, látex de formación de película, y mezclas de los mismos.

22. Uso de una membrana según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 21, en un dispositivo de detección de urea.

23. Uso según la reivindicación 22, en el que el dispositivo de detección de urea se selecciona de un electrodo potenciométrico selectivo de iones, un sensor óptico, un electrodo conductimétrico, y combinaciones de los mimos.

24. Uso según la reivindicación 22 o la reivindicación 23, en el que el dispositivo de detección de urea comprende un sensor microfabricado.

25. Uso según la reivindicación 24, en el que el sensor microfabricado comprende un electrodo selectivo de iones.

26. Uso según la reivindicación 24 o la reivindicación 25, en el que el sensor microfabricado responde a iones amonio.

27. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26, en el que dicha membrana permeable al agua es látex.

28. Dispositivo según la reivindicación 1. en el que el electrodo está recubierto con una primera capa, comprendiendo dicha primera capa un polímero plastificado, ionóforo de amonio, y en el que la ureasa y la anhidrasa carbónica están inmovilizadas en dicha primera capa.

29. Dispositivo según la reivindicación 1, en el que el electrodo está recubierto con una primera capa, comprendiendo dicha primera capa un polímero plastificado e ionóforo de amonio, y

una segunda capa ubicada sobre y en contacto con al menos una parte de dicha primera capa, comprendiendo dicha segunda capa una matriz permeable al agua en la que está incluida la ureasa inmovilizada y la anhidrasa carbónica inmovilizada.

30. Dispositivo según la reivindicación 29, en el que dicha ureasa y anhidrasa carbónica están inmovilizadas en dicha matriz permeable al agua.

31. Dispositivo de detección microfabricado para detectar urea en una muestra que comprende:

(a) un sustrato sustancialmente plano que tiene una superficie de microelectrodo estampada,

(b) una primera capa sobre al menos una parte de dicho sustrato que comprende un polímero plastificado y nonactina, y

(c) una segunda capa ubicada sobre al menos una parte de dicha primera capa, que comprende una matriz permeable al agua en la que está incluida al menos ureasa y anhidrasa carbónica,

en el que la ureasa y la anhidrasa carbónica están inmovilizadas sobre al menos una parte de un único electrodo, y

en el que el dispositivo está configurado para inhibir el intercambio de gases desde una disolución de muestra hacia un espacio de aire en una zona de la urea y anhidrasa carbónica inmovilizadas.

32. Dispositivo de detección microfabricado según la reivindicación 31, que comprende además una o más de las siguientes características:

(a) el polímero es poli(cloruro de vinilo);

(b) la superficie de microelectrodo estampada establece un potencial en respuesta a la presencia de iones amonio;

(c) la ureasa y anhidrasa carbónica están inmovilizadas en dicha matriz permeable al agua; y

(d) la primera y segunda capa están microdispensadas.

33. Método para someter a ensayo urea en una muestra, que comprende: poner en contacto una muestra que se sospecha que contiene urea con un sensor que comprende ureasa inmovilizada y anhidrasa carbónica inmovilizada, y

detectar un resto químico con un sensor seleccionado del grupo que consiste en un sensor de iones amonio, un sensor de pH, un sensor de dióxido de carbono, un sensor de bicarbonato, un sensor de conductividad,

en el que el dispositivo está configurado para inhibir el intercambio de gases desde la muestra hacia un espacio de aire en una zona de la ureasa inmovilizada y la anhidrasa carbónica inmovilizada.

34. Método según la reivindicación 33, en el que dicho resto químico es ión amonio.

35. Método según la reivindicación 34, en el que la cantidad de iones amonio detectada es una función de la cantidad de urea en la muestra.

36. Método según la reivindicación 35, en el que dicho sensor es potenciométrico y dicha función es sustancialmente logarítmica.

37. Método según cualquiera de las reivindicaciones 33 a 36, que comprende además calibrar dicho sensor exponiendo dicho sensor a un fluido acuoso, que contiene una cantidad conocida de iones amonio, antes o después de que dicha muestra se ponga en contacto con el sensor.

38. Método para mejorar la sensibilidad de un sensor de urea, comprendiendo el sensor un detector y ureasa inmovilizada, comprendiendo el método: añadir una cantidad eficaz de anhidrasa carbónica inmovilizada, a dicho sensor,

en el que dicho sensor está configurado para inhibir el intercambio de gases desde una muestra hacia un espacio de aire en una zona de la ureasa y la anhidrasa carbónica inmovilizadas.

39. Método según la reivindicación 38, en el que dicho detector comprende uno o más de los siguientes:

(a) un sensor selectivo de iones amonio;

(b) un sensor de pH;

(c) un sensor de dióxido de carbono o un sensor de bicarbonato; y

(d) un sensor de conductividad.

40. Método según la reivindicación 39, que comprende usar un segundo detector sin la ureasa y la anhidrasa carbónica para medir una señal de diferencia.