Regiones de expresión y estabilidad potenciadas.

Una célula aislada que comprende una secuencia potenciadora de la expresión seleccionada entre las SEC ID Nº 1

, 3 ó 5, y al menos un sitio de reconocimiento de recombinasa localizado dentro de una secuencia de nucleótidos de las SEC ID Nº 1, 3 ó 5.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2008/065733.

Solicitante: REGENERON PHARMACEUTICALS, INC..

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 777 OLD SAW MILL ROAD TARRYTOWN, NY 10591 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: FANDL, JAMES, P., CHEN,GANG, BABB,ROBERT.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/85 (para células animales)

PDF original: ES-2522615_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Regiones de expresión y estabilidad potenciadas Antecedentes Campo de la invención La invención proporciona la expresión de proteínas recombinante en células eucariotas. En particular, la invención se refiere a métodos para la expresión mejorada de proteínas en células eucariotas empleando secuencias de nucleótidos que potencian la expresión. La invención se refiere a secuencias de región de expresión y estabilidad potenciadas (EESYR) que facilitan la expresión potenciada y estable de proteínas recombinantes en células eucariotas, y métodos para usar dichas secuencias.

Descripción de la técnica relacionada El desarrollo de sistemas de expresión es un objetivo importante para proporcionar una fuente fiable y eficaz de una proteína determinada para uso de investigación y terapéutico. Con frecuencia se prefiere la expresión de proteínas recombinantes en células de mamífero para fabricar proteínas terapéuticas debido, por ejemplo, a la capacidad de los sistemas de expresión de mamíferos de modificar apropiadamente de forma post-traduccional las proteínas recombinantes.

Se dispone de diversos vectores para su expresión en hospedadores de mamífero, conteniendo cada uno diversas combinaciones de elementos reguladores en cis y, en algunos casos, en trans para conseguir niveles elevados de proteína recombinante con cortos tiempos de incubación. A pesar de la disponibilidad de muchos de estos vectores, a menudo la expresión de una proteína recombinante realizada en sistemas de mamífero es inaceptablemente baja o, de otro modo, insatisfactoria. Además, desarrollar una línea celular que exprese de forma fiable niveles suficientemente elevados de una proteína deseada a menudo requiere etapas de clonación y amplificación que consumen mucho tiempo. Por consiguiente, existe la necesidad en la técnica de sistemas de expresión mejorados en mamífero.

Schmerling Doron et al. describen la expresión fuerte y ubicua de transgenes dirigidos en el locus de beta-actina por remplazo del casete cre/lox (Journal of Genetics and Development, vol.42, pág. 229 a 235 (2005) ) .

Breve sumario La invención proporciona una célula aislada que comprende una secuencia potenciadora de la expresión seleccionada entre las SEC ID Nº 1, 3 ó 5, y al menos un sitio de reconocimiento de recombinasa localizado dentro de una secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 1, 3 ó 5. La invención también proporciona una célula CHO que comprende una secuencia potenciadora de la expresión que es los nucleótidos 6.400-6.500 de la SEC ID Nº 5, que comprende adicionalmente al menos un sitio de reconocimiento de recombinasa flanqueado 5' o 3' por un gen humano de interés (GOI) , opcionalmente donde el GOI humano está flanqueado 5' por el primer sitio de reconocimiento de recombinasa, y dicha célula CHO comprende adicionalmente un segundo sitio de reconocimiento de recombinasa que flanquea 3' el GOI humano. La invención proporciona adicionalmente una célula aislada que 45 comprende una secuencia potenciadora de la expresión seleccionada entre las SEC ID Nº 1, 3 ó 5 y al menos un GOI añadido de forma exógena dentro de la secuencia potenciadora de la expresión.

La invención proporciona adicionalmente un método para preparar una proteína de interés, que comprende: (a) proporcionar una célula hospedadora que comprende una secuencia potenciadora de la expresión seleccionada entre las SEC ID Nº 1, 3 ó 5, o los nucleótidos 6.400-6.500 de la SEC ID Nº 5, (b) introducir en la célula hospedadora, dentro de la secuencia potenciadora de la expresión un gen de interés (GOI) unido de forma funcional a un promotor; (c) mantener la célula hospedadora de (a) en condiciones que permitan al GOI expresar una proteína de interés; y (d) recuperar la proteína de interés. La invención proporciona adicionalmente el uso de la célula aislada de la invención o la célula CHO aislada de la invención para preparar un anticuerpo o fragmento del mismo.

También se describe en este documento una secuencia de nucleótidos aislada que comprende una secuencia potenciadora de la expresión seleccionada entre una secuencia de las SEC ID Nº 1-6, o un fragmento potenciador de la expresión de las mismas.

Las secuencias potenciadoras de la expresión descritas en este documento comprenden una secuencia potenciadora de la expresión de la SEC ID Nº 5 localizada en una posición dentro de la SEC ID Nº 5 seleccionada entre los nucleótidos que abarcan las posiciones numeradas 10-13.515; 20-12.020; 1.020-11.020; 2.020-10.020; 3.020-9.020; 4.020-8.020; 5.020-7.020; 6.020-6.920; 6.120-6.820; 6.220-6.720; 6.320-6.620; 6.420-6.520; 6.4606.500; 6.470-6.490; y 6.475-6.485. Otras secuencias potenciadoras de la expresión descritas en este documento se 65 seleccionan entre el grupo que consiste en los nucleótidos 5.000-7.400 de la SEC ID Nº 5; 5.000-6.500 de la SEC ID Nº 5; 6.400-7.400 de la SEC ID Nº 5; y los nucleótidos 6.400-6.500 de la SEC ID Nº 5.

El sitio de reconocimiento de recombinación puede posicionarse como se ha descrito anteriormente, con la condición de que la secuencia potenciadora de la expresión comprenda una secuencia que es al menos un 90% idéntica, más preferiblemente al menos un 95% idéntica, mucho más preferiblemente al menos un 99% idéntica, a la secuencia potenciadora de la expresión de la SEC ID Nº 5 o un fragmento potenciador de la expresión de la misma.

Las secuencias potenciadoras de la expresión puede comprender adicionalmente al menos un sitio de reconocimiento de recombinasa que comprende una secuencia independientemente seleccionada entre un sitio loxp, un sitio lox 511, un sitio lox 2272, y un sitio frt. El sitio de reconocimiento de recombinasa puede estar dentro de la secuencia potenciadora de la expresión. El sitio de reconocimiento de recombinasa puede estar inmediatamente adyacente en la dirección 5' al nucleótido terminal del extremo 5' o inmediatamente adyacente en la dirección 3' al nucleótido terminal del extremo 3' de la secuencia potenciadora de la expresión.

Pueden estar presentes al menos dos sitios de reconocimiento de recombinasa dentro de la secuencia potenciadora de la expresión. Pueden estar presentes dos sitios de reconocimiento de recombinasa de orientación opuesta dentro de la secuencia potenciadora de la expresión. Pueden estar presentes tres sitios de reconocimiento de recombinasa dentro de la secuencia potenciadora de la expresión.

En este documento también se describe una secuencia de nucleótidos aislada que comprende una secuencia potenciadora de la expresión que es al menos un 80% idéntica, preferiblemente al menos un 90% idéntica, más preferiblemente al menos un 95% idéntica, mucho más preferiblemente al menos un 99% idéntica a una secuencia potenciadora de la expresión de las SEC ID Nº 1-6 o un fragmento potenciador de la expresión de las mismas. La secuencia potenciadora de la expresión puede presentar la identidad indicada a una secuencia de la SEC ID Nº 5 como se ha descrito anteriormente.

En este documento se describe una célula eucariota aislada que comprende una secuencia potenciadora de la expresión seleccionada entre las SEC ID Nº 1-6 o un fragmento potenciador de la expresión de las mismas. La secuencia potenciadora de la expresión puede comprender una secuencia potenciadora de la expresión de la SEC ID Nº 5 como se ha descrito anteriormente.

La célula eucariota puede ser una célula de ratón, rata, hámster, o humana. La célula eucariota puede ser una célula CHO.

La célula eucariota puede comprender adicionalmente al menos una secuencia de reconocimiento de recombinasa dentro de la secuencia potenciadora de la expresión. La al menos una secuencia de reconocimiento de recombinasa puede seleccionarse... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Una célula aislada que comprende una secuencia potenciadora de la expresión seleccionada entre las SEC ID Nº

1, 3 ó 5, y al menos un sitio de reconocimiento de recombinasa localizado dentro de una secuencia de nucleótidos 5 de las SEC ID Nº 1, 3 ó 5.

2. La célula aislada de la reivindicación 1, donde el al menos un sitio de reconocimiento de recombinasa se selecciona entre el grupo que consiste en un sitio loxp, un sitio lox 511, un sitio lox 2272, y un sitio frt.

3. La célula aislada de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente un primer gen de interés (GOI) que codifica una proteína, donde el primer GOI se integra en el al menos un sitio de reconocimiento de recombinasa; opcionalmente donde el GOI está unido de forma funcional a un promotor.

4. La célula aislada de la reivindicación 3, que comprende adicionalmente un segundo GOI que codifica una

proteína, donde está presente un sitio de reconocimiento de recombinasa entre el primer GOI y el segundo GOI; que opcionalmente comprende adicionalmente un sitio de reconocimiento de recombinasa 5' al primer GOI y un sitio de reconocimiento de recombinasa 3' con respecto al segundo GOI.

5. La célula aislada de la reivindicación 1, donde la célula es una célula CHO, y donde la secuencia potenciadora de la expresión es la SEC ID Nº 5.

6. La célula aislada de la reivindicación 5, donde el sitio de reconocimiento de recombinasa está localizado en una posición entre los nucleótidos 5.000-7.400 de la SEC ID Nº 5; los nucleótidos 5.000-6.500 de la SEC ID Nº 5; los nucleótidos 6.400-7.400 de la SEC ID Nº 5; o los nucleótidos 6.400-6.500 de la SEC ID Nº 5.

7. Una célula CHO que comprende una secuencia potenciadora de la expresión que es los nucleótidos 6.400-6.500 de la SEC ID Nº 5, que comprende adicionalmente al menos un sitio de reconocimiento de recombinasa flanqueado 5' o 3' por un gen humano de interés (GOI) , opcionalmente donde el GOI humano está flanqueado 5' por el primer sitio de reconocimiento de recombinasa, y dicha célula CHO comprende adicionalmente un segundo sitio de reconocimiento de recombinasa que flanquea 3' el GOI humano.

8. La célula CHO de la reivindicación 7, que comprende adicionalmente un segundo GOI humano que flanquea 3' el segundo sitio de reconocimiento de recombinasa; que opcionalmente comprende adicionalmente un tercer sitio de reconocimiento de recombinasa que flanquea 3' el segundo GOI humano.

9. La célula CHO de la reivindicación 8, que comprende adicionalmente al menos un gen marcador entre el segundo sitio de reconocimiento de recombinasa y el segundo gen de interés.

10. La célula CHO de la reivindicación 9, que comprende adicionalmente un promotor unido de forma funcional al primer GOI humano y un promotor unido de forma funcional al segundo GOI; opcionalmente donde los promotores son promotores eucariotas, y los promotores eucariotas están unidos de forma funcional a un operador procariota.

11. La célula CHO de la reivindicación 10, donde el segundo y el tercero sitios de reconocimiento de recombinasa

están en una orientación opuesta al primer sitio de reconocimiento de recombinasa. 45

12. Una célula aislada que comprende una secuencia potenciadora de la expresión seleccionada entre las SEC ID Nº 1, 3 ó 5 y al menos un GOI añadido de forma exógena dentro de la secuencia potenciadora de la expresión.

13. La célula aislada de acuerdo con la reivindicación 12, donde la célula es una célula CHO, la secuencia potenciadora de la expresión comprende la SEC ID Nº 5, el al menos un GOI añadido de forma exógena es un gen humano, y el gen humano está unido de forma funcional a un promotor añadido de forma exógena.

14. Un método para preparar una proteína de interés, que comprende:

(a) proporcionar una célula hospedadora que comprende una secuencia potenciadora de la expresión seleccionada entre las SEC ID Nº 1, 3 ó 5, o los nucleótidos 6.400-6.500 de la SEC ID Nº 5,

(b) introducir en la célula hospedadora, dentro de la secuencia potenciadora de la expresión, un gen de interés (GOI) unido de forma funcional a un promotor;

(c) mantener la célula hospedadora de (a) en condiciones que permita que el GOI exprese una proteína de interés; y

(d) recuperar la proteína de interés.

15. La célula aislada, célula CHO o método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el primero y/o segundo GOI codifica una proteína seleccionada entre una cadena ligera de anticuerpo o fragmento específico 65 de antígeno de la misma, una cadena pesada de anticuerpo o fragmento específico de antígeno de la misma, un ligando, y un receptor o fragmento específico de ligando del mismo.

16. Uso de la célula aislada de la reivindicación 1 o la célula CHO de la reivindicación 7 para preparar un anticuerpo o fragmento del mismo.