Pruebas de coagulación sanguínea.

Un método para determinar la actividad de factor de coagulación proteolítico de la cascada de coagulación en sangre de una muestra,

comprendiendo el método:

a) suministrar en combinación en una mezcla de reacción:

(i) la muestra,

(ii) un agente de activación para activación directa o indirecta del factor de coagulación proteolítico de la cascada de coagulación sanguínea.

(iii) una estructura escindible la cual tiene un sitio de escisión que es escindible por el factor de coagulación proteolítico activado y en donde la estructura escindible está o llega a estar enlazada al agente quimioluminiscente y a un agente sensibilizador

(iv) un agente quimioluminiscente, y

(v) un agente sensibilizador en donde el agente quimioluminiscente y el agente sensibilizador están relacionados en que, cuando están en cercana proximidad, la energización del agente sensibilizador da como resultado la energización del agente quimioluminiscente;

(b) mención de la señal quimioluminiscente y relación de la señal de la actividad del factor de coagulación proteolítico de la cascada de coagulación sanguínea.

Pruebas de coagulación sanguínea La invención se relaciona con métodos para determinar la actividad de un factor de coagulación proteolítica de la cascada de coagulación de la sangre en un fluido corporal tal como sangre entera o plasma.

El proceso de la coagulación de la sangre y la subsecuente disolución del coágulo, después de la reparación del tejido lesionado, es llamado hemostasis, el cual es un proceso altamente complejo que involucra tanto componentes celulares como bioquímicos. La hemostasis está compuesta de cuatro principales eventos que ocurren en un orden definido que sigue a la lesión vascular. La coagulación se inicia casi instantáneamente después de que una lesión en el vaso sanguíneo daña el endotelio. La fase inicial del proceso se refiere a una constricción vascular, la cual limita el flujo de sangre al área de la lesión. A continuación, las plaquetas llegan a ser activadas por trombina e inmediatamente agregadas en el sitio de la lesión para formar un tampón hemostático en el sitio de la lesión; este proceso es llamado inicialmente hemostasis. La formación del tapón es estimulada por la proteína fibrinógeno. La hemostasis secundaria ocurre simultáneamente; las proteínas en el plasma sanguíneo, llamadas factores de coagulación, responden en una cascada compleja para formar hebras de fibrina, las cuales fortalecen el tapón de plaquetas. El factor de coagulación actúa en dos cascadas enlazadas íntimamente, referidas a rutas extrínsecas e intrínsecas. Pruebas de diagnóstico inicial de pacientes de los cuales se sospecha desórdenes de sangrado es usualmente llevado a cabo con el así llamado pruebas de coagulación, el tiempo de tromboplastina activada parcial (aPTT) y el tiempo de protrombina (PT) . Además, estas pruebas son también usadas para monitorizar terapias anticoagulantes. Mientras el aPTT es principalmente usado para la detección de deficiencias en factores de la ruta intrínseca y para monitorizar la terapia heparina, el PT es usado para la detección de la deficiencia en factores de la ruta extrínseca y para monitorizar la terapia de antagonistas de vitamina K. Ambos, el aPTT y el PT, pueden también ser usados para la detección de deficiencias de factores simples por mezcla de un plasma que es deficiente para el factor de coagulación para ser cuantificada con la muestra del paciente.

Muchos pacientes con desórdenes de sangrado heredado tienen prolongación del aPTT, el PT o ambos. Un paciente con un prolongado aPTT y un normal PT es considerado que tiene un defecto en la ruta de coagulación intrínseca. El nombre indica que todos los componentes de la prueba aPTT excepto kaolin, son "intrínsecos al plasma". Por otro lado, un paciente con un prolongado PT y un normal aPTT tiene un defecto en la ruta de coagulación extrínseca (el factor de tejido "es intrínseco" al plasma) . La prolongación de ambos aPTT y PT sugiere que el defecto yace en una ruta común.

En la reacción PT, la coagulación se inicia en una muestra de plasma del paciente por activación de la ruta extrínseca, esto es por adición de una mezcla de un factor de tejido, fosfolípidos e iones calcio. Subsecuentemente, se determina el tiempo hasta que la trombina que es generada ha convertido suficiente fibrinógeno en un coágulo de fibrina visible. Este es un método de detección relativamente insensible que también requiere volúmenes de muestra altos.

La ruta extrínseca (o factor de tejidos) genera una "explosión de trombinas", la cual es un proceso por el cual la trombina, el más importante constituyente de la cascada de coagulación en términos de su papel de activación de retroalimentación, es liberada instantáneamente. Siguiendo al daño del vaso sanguíneo o tejido, el Factor tejido (TF) es liberado, formando un complejo con Factor VII y activándolo. El Factor TF complejo VIIa activa entonces los Factores IX y X. el Factor Xa y su cofactor el Factor Va forma el complejo de protrombinasa, el cual activa la protrombina a trombina. La trombina subsecuentemente activa otros componentes de la cascada de coagulación, incluyendo los factores V y VII, y activa y libera el factor VII de estar enlazado al factor de von Willebrand (vWF) . Finalmente, la trombina convierte el fibrinógeno en fibrina insoluble y por lo tanto genera un coágulo. El factor XIII subsecuentemente estabiliza el coágulo de fibrina.

La ruta intrínseca (o contacto de activación) comienza con la formación del complejo primario que consiste de fibrinógeno de alto peso molecular (HMWK) , prekalikreina, y Factor XII. La prekalikreina es convertida en kalikreina y activa el Factor XII a XIIa. El Factor XIIa convierte al Factor XI en Factor XIa. El Factor XIa activa el Factor IX, el cual junto con su cofactor Factor VIIIa forma el complejo tenasa, el cual activa el Factor X a Factor Xa. Así en la ruta extrínseca, el factor Xa y su cofactor el factor Va forma el complejo protrombinasa, el cual activa de nuevo la protrombina a trombina.

El concepto de rutas "intrínseca" y "extrínseca" ha servido por muchos años como un modelo útil para la coagulación. La evidencia ha mostrado que las rutas no son redundantes pero están altamente interconectadas. Por ejemplo, el factor tejido/Factor complejo VIIa activa no solo el Factor X sino también el Factor IX de la ruta intrínseca. Adicionalmente los pacientes con severa deficiencia del Factor VII pueden sangrar aunque la ruta intrínseca esté intacta. Además, el sangrado severo asociado con deficiencias del Factor VIII o IX no se esperaría necesariamente si la ruta extrínseca sola fuera suficiente para alcanzar la hemostasis normal. Los sistemas intrínseco y extrínseco convergen en un factor X a una ruta común simple que es finalmente responsable para la producción de trombina (Factor IIa) . Aunque son inicialmente mecanismos distintos, las rutas intrínseca y extrínseca convergen en una ruta común que lleva a la formación de un coágulo.

La cuantificación exacta de las actividades bioquímicas de las rutas completas tanto extrínseca como intrínseca así como de sus factores de coagulación respectivos es altamente importante para el diagnóstico de desórdenes de sangrado, trombofilia, y también para monitorización de la terapia de anticoagulante, y similares. Métodos de pruebas actuales para la actividad de las rutas miden usualmente fotométricamente el tiempo hasta la aparición de un coágulo de fibrina, después de la respectiva ruta que ha sido disparada en una muestra de plasma. Versiones modificadas de este principio básico existen para la cuantificación de las actividades de los factores de coagulación simple. Estos métodos fotométricos a menudo pierden la sensibilidad que es requerida para la cuantificación exacta de las bajas cantidades de algunos factores de coagulación tal como Factor VIII, que generalmente requiere volúmenes de muestra altos, y puede por lo tanto ser llevado a cabo con plasma y no con muestras de sangre entera.

La patente de los Estados Unidos 5, 340, 716 describe un método de prueba para determinar la capacidad de coagulación en una muestra de sangre entera en donde la muestra está en contacto con un iniciador de coagulación y una escisión de sustrato péptido unido a una molécula informadora cromogénica, quimioluminiscente o fluorescente. Sin embargo, el método requiere el uso de un dispositivo de prueba sofisticado que comprende una membrana permeable la cual retiene los glóbulos rojos para prevenir la interferencia con una generación o medida de señal.

Otro grupo de métodos de prueba son pruebas cromogénicas que miden la actividad enzimática o cofactor de los factores de coagulación. En estas pruebas, se usan péptidos cromogénicos que pueden ser escindidos específicamente por factores de coagulación, por lo tanto liberando una molécula de detección que inhibe la acción del cromóforo, el cual resulta en un cambio de color que puede ser cuantificado fotométricamente. Estos métodos comparten restricciones similares que existen para las pruebas de detección de coágulos, esto es baja sensibilidad e incompatibilidad con muestra de sangre entera. Han sido descritas modificaciones de este protocolo que emplean otras tecnologías de detección (e.g. transferencia de energía resonancia fluorescencia o FRET) . No es claro si estos métodos superan las restricciones de las pruebas basados en los conjugados cromóforo/péptido de detención o si estos métodos son efectivos con muestras de pacientes reales, puesto que estos métodos han sido únicamente evaluados con componentes purificados. Adicionalmente, los métodos que involucran FRET presentan dificultades técnicas tales como dificultad... [Seguir leyendo]

1. Un método para determinar la actividad de factor de coagulación proteolítico de la cascada de coagulación en sangre de una muestra, comprendiendo el método:

a) suministrar en combinación en una mezcla de reacción:

(i) la muestra,

(ii) un agente de activación para activación directa o indirecta del factor de coagulación proteolítico de la cascada de coagulación sanguínea.

(iii) una estructura escindible la cual tiene un sitio de escisión que es escindible por el factor de coagulación proteolítico activado y en donde la estructura escindible está o llega a estar enlazada al agente quimioluminiscente y a un agente sensibilizador

(iv) un agente quimioluminiscente, y

(v) un agente sensibilizador

en donde el agente quimioluminiscente y el agente sensibilizador están relacionados en que, cuando están en cercana proximidad, la energización del agente sensibilizador da como resultado la energización del agente quimioluminiscente;

(b) mención de la señal quimioluminiscente y relación de la señal de la actividad del factor de coagulación proteolítico de la cascada de coagulación sanguínea.

2. El método de la reivindicación 1 en donde la estructura escindible está contenida en un reactivo separado el cual es adicionado a la mezcla de reacción.

3. El método de la reivindicación 2 en donde la estructura escindible está enlazada al agente quimioluminiscente y/o al agente sensibilizador en el reactivo separado.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 2 y 3 en donde la estructura escindible comprende un péptido de 3 a 150 unidades de monómeros de longitud.

5. El método de la reivindicación 1 en donde la estructura escindible es un sustrato natural del factor de coagulación proteolítico el cual está contenido en la muestra y el cual llega a estar enlazado con el agente quimioluminiscente y con el agente sensibilizador en la mezcla de reacción.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde la muestra es sangre entera o plasma.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde el agente sensibilizador es un fotosensibilizador que genera oxígeno singlete sobre la radiación y oxígeno singlete que energiza el agente quimioluminiscente.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde el agente quimioluminiscente comprende una partícula que tiene asociada con la misma un componente quimioluminiscente.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde el agente sensibilizador comprende una partícula que tiene asociado con la mima un compuesto sensibilizador

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde la señal quimioluminiscente es universalmente proporcional a la actividad del factor de coagulación proteolítico activado.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde el factor de coagulación proteolítico se selecciona del grupo que consiste de Factor II, Factor VII, Factor IX, Factor X, Factor XI, Factor XII y proteína C.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde el agente de activación para activación directa o indirecta del factor de coagulación proteolítica se selecciona del grupo que consiste de tromboplastina, Factor IIa, Factor VIIa, Factor IXa, Factor Xa, Factor XIa, Factor XIIa, y proteína C activada, veneno de serpiente, fosfolípidos

cargados negativamente, iones calcio, factores de tejido, sílica, caolín, ácido elágico y celita.

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde la actividad del factor de coagulación proteolítico activado es indicativa de la presencia o actividad de uno o más componentes de la muestra que va a ser analizada que influencia la actividad del factor de coagulación proteolítico.

14. El método de acuerdo a una de las reivindicaciones precedentes en donde adicionalmente se adiciona a la mezcla de reacción plasma o sangre entera la cual es deficiente en un componente individual el cual influencia la actividad del factor de coagulación proteolítico por ser determinado y en donde la actividad del factor de coagulación proteolítico que va a ser determinado es indicativa del dicho componente unitario en la muestra.

15. El método de acuerdo a la reivindicación 1 en donde la actividad del factor de coagulación proteolítico activado es 10 indicativa de la funcionalidad de la ruta intrínseca de la cascada de coagulación sanguínea.

16. El método de acuerdo con la reivindicación 1 en donde la actividad del factor de coagulación proteolítico activado es indicativa de la funcionalidad de la ruta extrínseca de la cascada de coagulación sanguínea.

17. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde la actividad del factor de coagulación proteolítico activado es indicativa de la presencia de uno o más anticoagulantes terapéuticos.

18. Un kit para uso en un método de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, comprendiendo el kit los siguientes componentes:

(a) un agente de activación para la activación directa o indirecta del factor de coagulación proteolítico de la cascada de coagulación sanguínea

(b) un agente quimioluminiscente,

(c) un agente sensibilizador, y (d) una estructura escindible la cual tiene un sitio de escisión que es escindible por un factor de coagulación proteolítico activado y la cual tiene medios para enlazar el agente quimioluminiscente y un agente sensibilizador.

19. Un kit de acuerdo con la reivindicación 18 en donde la estructura escindible está enlazada al agente quimioluminiscente y/o al agente sensibilizador.

Figura 1