PROTEÍNAS DE FUSIÓN.

Una proteína de fusión de polipéptido monocatenario que comprende: a) una proteasa no citotóxica

, o un fragmento de la misma, dicha proteasa o fragmento de proteasa es capaz de escindir una proteína del aparato de fusión exocítica de un aferente sensorial nociceptor; b) un resto director que es capaz de unirse a un sitio de unión en el aferente sensorial nociceptor, dicho sitio de unión es capaz de experimentar endocitosis para incorporarse a un endosoma contenido en el aferente sensorial nociceptor; c) un sitio de escisión de proteasa en cuyo sitio la proteína de fusión se puede escindir mediante una proteasa, en el que el sitio de escisión de la proteasa está ubicado entre la proteasa no citotóxica o fragmento de la misma y el resto director; d) un dominio de translocación que es capaz de translocar la proteasa o fragmento de la proteasa del interior de un endosoma, a través de la membrana endosómica y al citosol del aferente sensorial nociceptor; en el que el resto director se ubica entre el sitio de escisión de la proteasa y el dominio de translocación; y en el que el resto director y el sitio de escisión de la proteasa están separados por cero restos de aminoácidos

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/GB2005/004585.

Solicitante: Health Protection Agency
Allergan, Inc.

Nacionalidad solicitante: Reino Unido.

Dirección: Porton Down SalisburyWiltshire SP4 0JG.

Inventor/es: AOKI, K ROGER, FOSTER, KEITH, Chaddock,John, Marks,Philip, Stancombe,Patrick, Francis,Joseph, Steward,Lance.

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 1 de Diciembre de 2005.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen péptidos... > A61K38/48 (que actúan sobre enlaces peptídicos (3.4))
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen ingredientes... > A61K31/711 (Acidos desoxirribonucleicos naturales, es decir conteniendo unicamente 2'-desoxirribosas unidas a la adenina, la guanina, la citosina o la timina y teniendo enlaces 3'-5' fosfodiester)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas;... > C07K14/33 (de Clostridium (G))
  • A61K47/48R2
  • A61K38/48N
  • A61K47/48R2D

Clasificación PCT:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/62 (Secuencias de ADN que codifican proteínas de fusión)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > C07K19/00 (Péptidos híbridos (Inmoglobulinas híbridas compuestas   solamente de inmoglobulinas C07K 16/46))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas;... > C07K14/435 (de animales; de humanos)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen péptidos... > A61K38/16 (Péptidos que tienen más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados)

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia.

PDF original: ES-2356179_T3.pdf

 

google+ twitter facebookPin it
Ilustración 1 de PROTEÍNAS DE FUSIÓN.
Ilustración 2 de PROTEÍNAS DE FUSIÓN.
Ilustración 3 de PROTEÍNAS DE FUSIÓN.
Ilustración 4 de PROTEÍNAS DE FUSIÓN.
Ver la galería de la patente con 8 ilustraciones.
PROTEÍNAS DE FUSIÓN.

Fragmento de la descripción:

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Esta invención se refiere a proteínas de fusión no citotóxicas, y a las aplicaciones terapéuticas de las mismas como moléculas analgésicas.

Por lo general, las toxinas se pueden dividir en dos grupos según el tipo de efecto que tienen sobre una 5 célula diana. Con más detalle, el primer grupo de toxinas mata sus células dianas naturales, y por tanto se conocen como moléculas toxinas citotóxicas. Este grupo de toxinas se ejemplifica inter alia mediante toxinas vegetales como ricina, y abrina, y por toxinas bacterianas como la toxina de la difteria, y la exotoxina A de Pseudomonas. Las toxinas citotóxicas han atraído mucho interés para el diseño de "balas mágicas" (por ejemplo, inmunoconjugados, que comprenden un componente de toxina citotóxica y un anticuerpo que se une a un marcador específico de una célula 10 diana) para el tratamiento de trastornos y dolencias celulares como el cáncer. Las toxinas citotóxicas matan típicamente sus células diana al inhibir los procesos celulares de la síntesis de proteínas.

El segundo grupo de toxinas, que se conocen como toxinas no citotóxicas no matan (como su nombre confirma) sus células dianas naturales. Las toxinas no citotóxicas han atraído mucho menos interés comercial que sus equivalentes citotóxicas, y ejercen su efecto sobre una célula diana por inhibición de procesos celulares distintos a la 15 síntesis de proteínas. Las toxinas no citotóxicas se producen por diferentes plantas y por diferentes microorganismos, tales como Clostridium sp. y Neisseria sp.

Las neurotoxinas clostrídicas son proteínas que típicamente tienen un peso molecular de aproximadamente 150 kDa. Son producidas por diferentes especies de bacterias, especialmente del género Clostridium, de forma más importante C. tetani y varias cepas de C. botulinum, C. butyricum y C. argentinense. En la actualidad 20 existen ocho clases diferentes de las neurotoxinas clostrídicas, concretamente: toxina tetánica, y toxina botulínica en sus serotipos A, B, C1, D, E, F y G, y todas comparten estructuras y modos de acción similares.

Las neurotoxinas clostrídicas representan un grupo principal de moléculas toxinas no citotóxicas, y se sintetizan por la bacteria hospedadora en forma de polipéptidos simples que se modifican post-traduccionalmente mediante un episodio de escisión proteolítica para formar dos cadenas polipeptídicas unidas entre sí por un puente 25 disulfuro. Las dos cadenas se denominan la cadena pesada (cadena H), que tiene un peso molecular de aproximadamente 100 kDa, y la cadena ligera (cadena L), que tiene un peso molecular de aproximadamente 50 kDa.

Las cadenas L tienen una función proteasa (actividad endopeptidasa dependiente de cinc) y muestran una elevada especificidad de sustrato para las proteínas asociadas a vesículas y/o membrana plasmática implicadas en el proceso exocítico. Las cadenas L procedentes de diferentes especies o serotipos clostridiales pueden hidrolizar 30 enlaces peptídicos diferentes pero específicos en tres proteínas sustrato, concretamente sinaptobrevina, sintaxina o SNAP-25. Estos sustratos son componentes importantes de la maquinaria neurosecretora.

Neisseria sp., principalmente de la especie N. gonorrhoeae, produce proteasas no citotóxicas funcionalmente similares. Un ejemplo de una proteasa de ese tipo es un proteasa IgA (consultar el documento WO99/58571). 35

Está bien documentado en la técnica que las moléculas toxinas se pueden redirigir a una célula que no sea la célula diana natural de la toxina. Cuando se redirigen, la toxina modificada es capaz de unirse a una célula diana deseada y, tras la translocación posterior en el citosol, es capaz de ejercer su efecto sobre las células diana. Dicho redireccionamiento se consigue al sustituir el Resto de Direccionamiento (TM) natural de la toxina por un TM diferente. A este respecto, el TM se selecciona de forma que se unirá a la célula diana deseada, y permitirá el paso posterior de la 40 toxina modificada a un endosoma contenido en la célula diana. La toxina modificada comprende también un dominio de translocación que permite la entrada de la proteasa no citotóxica al citosol de la célula. El dominio de translocación puede ser el dominio de translocación natural de la toxina o puede ser un dominio de translocación diferente obtenido a partir de una proteína microbiana con actividad de translocación.

Por ejemplo, el documento WO94/21300 describe moléculas modificadas de neurotoxina clostrídica que 45 son capaces de regular la densidad de Proteína Integral de Membrana (IMP) en la superficie celular de la célula diana. Las moléculas de neurotoxina modificadas son por tanto capaces de controlar la actividad celular (por ejemplo, la recaptación de glucosa) de la célula diana. Los documentos WO96/33273 y WO99/17806 describen moléculas modificadas de neurotoxina clostrídica que se dirigen a aferentes sensoriales periféricos. Las moléculas modificadas de neurotoxina son por tanto capaces de demostrar un efecto analgésico. El documento WO00/10598 describe la 50 preparación de moléculas modificadas de neurotoxina clostrídica que se dirigen a células hipersecretoras de moco (o a las células neuronales que controlan dichas células hipersecretoras de moco), dichas neurotoxinas modificadas son capaces de inhibir la hipersecreción procedente de dichas células. El documento WO01/21213 describe moléculas modificadas de neurotoxina clostrídica que se dirigen a una amplia gama de tipos diferentes de células diana no neuronales. Las moléculas modificadas son por tanto capaces de evitar la secreción desde las células diana. Otras 55

publicaciones en el campo técnico de las moléculas de toxina redirigida incluyen los documentos: WO00/62814; WO00/04926; US5.773.586; WO93/15766; WO00/61192; y WO99/58571.

La sustitución de TM anteriormente mencionada puede llevarse a cabo mediante técnicas convencionales de conjugación química, que son bien conocidas del experto en la técnica. A este respecto, se hace referencia a Hermanson, G.T. (1996), Bioconjugate techniques, Academic Press, y a Wong, S.S. (1991), Chemistry of protein 5 conjugation and cross-linking, CRC Press.

Sin embargo, la conjugación química a menudo es imprecisa. Por ejemplo, tras la conjugación, un TM puede quedar unido a lo que resta de conjugado en más de un sitio de unión.

La conjugación química también es difícil de controlar. Por ejemplo, un TM puede quedar unido a lo que resta de la toxina modificada en un sitio de unión del componente de proteasa y/o en el componente de translocación. 10 Esto es un problema cuando se desea solo la unión a uno de dichos componentes (preferiblemente en un único sitio) para conseguir eficiencia terapéutica.

De este modo, la conjugación química da como resultado una población mixta de moléculas de toxina modificada. lo que es indeseable.

Como alternativa a la conjugación química, la sustitución de TM se puede llevar a cabo por preparación 15 de una proteína de fusión de un único polipéptido (consultar el documento WO98/07864). Esta técnica se basa en el mecanismo bacteriano in vivo por el cual se prepara la neurotoxina clostrídica natural (es decir, la holotoxina) y el resultado es una proteína de fusión que tiene la siguiente disposición estructural:

NH2 – [componente de proteasa] - [componente de translocación] - [TM] - COOH

... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Una proteína de fusión de polipéptido monocatenario que comprende:

a) una proteasa no citotóxica, o un fragmento de la misma, dicha proteasa o fragmento de proteasa es capaz de escindir una proteína del aparato de fusión exocítica de un aferente sensorial nociceptor;

b) un resto director que es capaz de unirse a un sitio de unión en el aferente sensorial nociceptor, dicho sitio 5 de unión es capaz de experimentar endocitosis para incorporarse a un endosoma contenido en el aferente sensorial nociceptor;

c) un sitio de escisión de proteasa en cuyo sitio la proteína de fusión se puede escindir mediante una proteasa, en el que el sitio de escisión de la proteasa está ubicado entre la proteasa no citotóxica o fragmento de la misma y el resto director; 10

d) un dominio de translocación que es capaz de translocar la proteasa o fragmento de la proteasa del interior de un endosoma, a través de la membrana endosómica y al citosol del aferente sensorial nociceptor; en el que el resto director se ubica entre el sitio de escisión de la proteasa y el dominio de translocación; y en el que el resto director y el sitio de escisión de la proteasa están separados por cero restos de aminoácidos.

2. La proteína de fusión según cualquier reivindicación anterior, en la que proteasa no citotóxica es una 15 cadena L de la toxina clostrídica o una proteasa IgA.

3. La proteína de fusión según cualquier reivindicación anterior, en la que el dominio de translocación es el dominio HN de una neurotoxina clostrídica.

4. La proteína de fusión según cualquier reivindicación anterior, en la que el resto director comprende un máximo de 50 restos de aminoácidos, preferiblemente como máximo 40 restos de aminoácidos, más preferiblemente 20 como máximo 30 restos de aminoácidos, y lo más preferiblemente como máximo 20 restos de aminoácidos

5. La proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que el resto director es un opioide.

6. La proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que el resto director es un agonista de un receptor presente en el aferente sensorial nociceptor. 25

7. La proteína de fusión según la reivindicación 6, en la que el resto director es un agonista de un receptor presente en un aferente sensorial nociceptor primario.

8. La proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el resto director se une al receptor ORL1.

9. La proteína de fusión según la reivindicación 8, en el que el resto director se une al receptor ORL1 30 específicamente.

10. La proteína de fusión según la reivindicación 8 o 9, en la que el resto director es un agonista del receptor ORL1.

11. La proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 8-10, en la que el resto director tiene 35 una homología de al menos un 70% respecto de la SEQ ID No. 38 o un fragmento de la misma.

12. La proteína de fusión según la reivindicación 11, en la que el resto director tiene una homología de al menos un 80% respecto de la SEQ ID No. 38 o un fragmento de la misma.

13. La proteína de fusión según la reivindicación 12, en la que el resto director tiene una homología de al menos un 90% respecto de la SEQ ID No. 38 o un fragmento de la misma. 40

14. La proteína de fusión según la reivindicación 13, en la que el resto director tiene una homología de al menos un 95% respecto de la SEQ ID No. 38 o un fragmento de la misma.

15. La proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 8-10, en la que el resto director es la SEQ ID No. 38 o un fragmento de la misma.

16. La proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 8-10, en la que el resto director es una de 45 las SEQS ID NO: 40, 42, 44, 46, 48 o 50.

17. La proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 8-10, en la que el resto director es un nociceptina.

18. La proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que el resto director se selecciona entre el grupo constituido por nociceptina, β-endorfina, endomorfina-1, endomorfina-2, dinorfina, met-encefalina, leu-encefalina, galanina, y péptido PAR-2.

19. La proteína de fusión según cualquier reivindicación anterior, en la que la proteína de fusión comprende una etiqueta de purificación. 5

20. La proteína de fusión según la reivindicación 19, en la que la proteína de fusión comprende una etiqueta de purificación, que está presente en el extremo N y/o en el extremo C de la proteína de fusión.

21. La proteína de fusión según la reivindicación 19 o 20, en la que la etiqueta de purificación está unida a la proteína de fusión mediante una molécula péptido separador.

22. La proteína de fusión según cualquier reivindicación anterior, en la que el dominio de translocación está 10 separado del resto director por una molécula péptido separador.

23. Una proteína de fusión de polipéptido según la reivindicación 1, que comprende una cualquiera de las SEQS ID NO: 14, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 59, 61, 64, 67, 69, 71, 73, 76, 79, 82, 85, u 88.

24. Una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores. 15

25. Una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 24, en el que la molécula de ácido nucleico comprende una cualquiera de las SEQS ID NO: 1-13, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 58, 60, 63, 66, 68, 70, 72, 75, 78, 81, 84, u 87.

26. Un vector de ADN, que comprende un promotor, una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 24 o la reivindicación 25, en el que dicha secuencia de ADN se ubica en dirección 3‟ del promotor, y un terminador se 20 ubica en dirección 3‟ de la construcción de ADN.

27. Un procedimiento para preparar una proteína del polipéptido de fusión monocatenario según cualquiera de las reivindicaciones 1-23, que comprende expresar una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 24 o la reivindicación 25, o un vector de ADN según la reivindicación 26, en una célula hospedadora.

28. Un procedimiento para preparar un agente no citotóxico, que comprende: 25

a) poner en contacto una proteína del polipéptido de fusión monocatenario según cualquiera de las reivindicaciones 1-23 con una proteasa capaz de escindir el sitio de escisión de la proteasa;

b) escindir el sitio de escisión de la proteasa; y formar de esta manera una proteína de fusión bicatenaria.

29. Un polipéptido no citotóxico, que se puede obtener según el procedimiento de la reivindicación 28, en el que dicho polipéptido es un polipéptido bicatenario, y en el que: 30

a) la primera cadena comprende dicha proteasa no citotóxica, o fragmento de la misma;

b) la segunda cadena comprende dicho resto director y dicho dominio de translocación, en el que dicho resto director se encuentra en el extremo N con respecto a dicho dominio de translocación; y dichas cadenas primera y segunda están unidas entre sí mediante disulfuro.

30. Uso de una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1-23 o un polipéptido según la 35 reivindicación 29, en la fabricación de un medicamento para tratar, prevenir o aminorar el dolor; preferiblemente cuando el dolor es dolor crónico.

31. Una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1-23 o un polipéptido según la reivindicación 29, para uso en el tratamiento, prevención o para aminorar el dolor, preferiblemente cuando el dolor es dolor crónico. 40