Método para la producción de un ácido hialurónico con un peso molecular promedio bajo mediante fermentación controlada de temperatura,

incluyendo el método los pasos de: (a) cultivo de una célula huésped recombinante de Bacillus a una primera temperatura propicia para su crecimiento, donde la célula huésped de Bacillus comprende un constructo de ácidos nucléicos que comprende una secuencia codificante de hialuronano sintasa operativamente enlazada a una secuencia promotora exógena a la secuencia codificante de hialuronano sintasa; (b) a continuación, cultivo de la célula huésped recombinante de Bacillus del paso (a) a una segunda temperatura superior a la primera temperatura del paso (a) según condiciones adecuadas para la producción del ácido hialurónico, donde la segunda temperatura es del orden de 40ºC-52ºC y al menos 5ºC superior a la primera temperatura, por lo cual la célula huésped de Bacillus produce ácido hialurónico con un peso molecular promedio deseado en la gama seleccionada del grupo de las gamas de peso molecular que consisten en 300-400 kDa, 400-500 kDa, 500-600 kDa, 600-700 kDa, 700-800 kDa; y (c) recuperación del ácido hialurónico

Producción de ácido hialurónico de bajo peso molecular.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos para la producción recombinante de ácido hialurónico (HA o hialuronano) con un peso molecular (PM) promedio bajo en una célula huésped de Bacillus mediante fermentación de temperatura controlada. La célula huésped productora de HA se fermenta previamente a una temperatura propicia para su crecimiento y a continuación se cambia a una temperatura más alta favorable para la producción de HA del PM bajo deseado. La temperatura y el pH favorable para la producción de HA de PM bajo puede en alguna situación diferir incluso de las gamas de pH y temperatura consideradas normalmente favorables para el crecimiento del microorganismo que se fermenta.

Antecedentes de la invención

Los heteropolisacáridos más abundantes del cuerpo son los glicosaminoglicanos. Los glicosaminoglicanos son polímeros de carbohidratos de cadena recta que consisten en repetir unidades de disacáridos (sólo el queratán sulfato se ramifica en la región de núcleo de los carbohidratos). Las unidades de disacáridos generalmente comprenden, como primera unidad sacárida, uno de los dos azúcares modificados N-acetilgalactosamina (GalNAc) o N-acetilglucosamina (GlcNAc). La segunda unidad es normalmente un ácido urónico, tal como un ácido glucurónico (GlcUA) o iduronato.

Los glicosaminoglicanos son moléculas de carga negativa y tienen una conformación extendida que proporciona una alta viscosidad en solución. Los glicosaminoglicanos se localizan principalmente en la superficie de las células o en la matriz extracelular. Los glicosaminoglicanos también tienen una comprimibilidad baja en solución y, como resultado, son ideales como fluido de lubricación fisiológico, por ejemplo, para las articulaciones. La rigidez de los glicosaminoglicanos proporciona integridad estructural a las células y proporciona vías de paso entre las células, teniendo en cuenta la migración celular. Los glicosaminoglicanos de mayor importancia fisiológica son el hialuronano, el sulfato de condroitina, heparina, heparán sulfato, dermatán sulfato y queratán sulfato. Muchos glicosaminoglicanos enlazan de manera covalente con una proteína del núcleo de proteoglicanos mediante estructuras específicas de oligosacáridos. El hialuronano forma grandes agregados con determinados proteoglicanos, pero es una excepción, ya que las cadenas de carbohidratos libres forman complejos no covalentes con proteoglicanos.

El ácido hialurónico se define aquí como un glicosaminoglicano no sulfatado compuesto mediante la repetición de unidades de disacárido de N-Acetilglucosamina (GlcNAc) y ácido glucurónico (GlcUA) enlazadas alternando enlaces glicosídicos beta-1,4 y beta-1,3. El ácido hialurónico es también conocido como hialuronano, hialuronato o HA. Los términos hialuronano y ácido hialurónico se usan aquí de forma intercambiable.

Numerosas funciones del hialuronano en el cuerpo han sido identificadas (ver, Laurent T. C. y Fraser J. R. E., 1992, FASEB J. 6: 2397-2404; y Toole B.P., 1991, "Proteoglycans and hyaluronan in morphogenesis and differentiation". en: Cell Biology of the Extracellular Matrix, págs. 305-341, Hay E. D., ed., Plenum, Nueva York). El hialuronano está presente en el cartílago hialino, en el líquido sinovial de las articulaciones y en los tejidos de la piel, tanto dermis como epidermis. Se cree que el hialuronano desarrolla también un papel en numerosas funciones fisiológicas, tales como adhesión, desarrollo, motilidad celular, cáncer, angiogénesis y cicatrización de una herida. Debido a las propiedades biológicas y físicas únicas del hialuronano, se emplea en cirugía ocular y articular, y está siendo probado en otros procedimientos médicos. También se han desarrollado productos de hialuronano para su uso en ortopedia, reumatología, y dermatología.

Las crestas de gallo son una fuente comercial significativa de hialuronano. Los microorganismos son una fuente alternativa. La patente estadounidense nº. 4.801.539 divulga un método de fermentación para preparar ácido hialurónico que incluye una cepa de Streptococcus zooepidemicus con rendimientos proporcionados de aproximadamente 3,6 g de ácido hialurónico por litro. La patente europea nº. EP0694616 divulga procesos de fermentación usando una cepa mejorada de Streptococcus zooepidemicus con rendimientos registrados de aproximadamente 3,5 g de ácido hialurónico por litro.

Los microorganismos usados para la producción de ácido hialurónico por fermentación son cepas de bacterias patógenas, siendo las más importantes entre éstas diferentes Streptococcus spp. El grupo A y el grupo C de estreptococos se rodean ellos mismos con una cápsula no antigénica compuesta por hialuronano, que tiene una composición idéntica a la encontrada en el tejido conjuntivo y las articulaciones. Pasteurella multocida, otra bacteria que encapsula patógenos, también circunda sus células con hialuronano.

Hialuronano sintasas han sido descritas a partir de vertebrados, patógenos bacterianos y virus de algas (DeAngelis, P. L., 1999, Cell. Mol. Life Sci. 56: 670-682). WO 99/23227 divulga un Grupo I de hialuronano sintasa de Streptococcus equisimilis. WO 99/51265 y WO 00/27437 describen un Grupo II de hialuronano sintasa de Pasteurella multocida. Ferretti et al. revelan el operón de hialuronano sintasa de Streptococcus pyogenes, que está compuesto de tres genes, hasA, hasB, y hasC, que codifican hialuronano sintasa, UDP-glucosa deshidrogenase y UDP-glucosa pirofosforilasa respectivamente (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 4658-4663, 2001). WO 99/51265 describe un segmento de ácido nucleico con una región codificante para una hialuronato sintasa de Streptococcus equisimilis.

La producción de ácido hialurónico, particularmente de peso molecular promedio bajo, tal como, inferior a 1 MDa, se consigue más frecuentemente aislando inicialmente el material de peso molecular más alto (>1MDa) del caldo de fermentación o de las fuentes animales. La reducción deseada en peso molecular se consigue entonces, típicamente, mediante el fraccionamiento mediante medios mecánicos/físicos o por medios químicos.

El fraccionamiento ha sido realizado sobre una membrana de tamaño selectivo con las fracciones resultantes de un peso molecular medio del orden de 30.000-730.000 Dalton, siendo las moléculas más grandes retenidas por la membrana. También se establece correctamente una precipitación solvente, las moléculas más grandes son precipitadas primero, pero este método carece de la resolución de fraccionamiento de membrana. En general, los métodos de fraccionamiento tienden a ser favorables para aislar moléculas más grandes y no son realmente adecuados para la producción de moléculas pequeñas.

Usando medios mecánicos, las moléculas se someten a una tensión de cizallamiento suficiente para causar rotura. Por ejemplo, material de HA de 1.700.000 Da se puede reducir por debajo de 500.000 Da en un homogenizador de alta presión (WO9104279-A). El método se puede aumentar proporcionalmente con, por ejemplo, máquinas tipo Manton-Gaulin, estando éstas disponibles en varias escalas y siendo capaces de procesar material a índices de 10 1/h hasta del orden de varios m³/h.

Se ha comprobado que medios físicos, tales como la exposición a ultrasonidos, también funcionan, pero resulta difícil implementar tales métodos para algo mucho más grande que la escala de laboratorio (Orvisky et al. 1993. Size exclusión chromatographic characterization of sodium hyaluronate fractions prepared by high energetic sonication. Chromatographia vol. 37 (1-2): 20-22).

Medios químicos, tales como hidrólisis a los valores extremos de pH, también han sido descritos, o en presencia de otros productos químicos. Tales métodos pueden ser inadecuados si el mediador de pH o químico no debe estar presente en el producto final, o si es necesario un control fino para iniciar y detener el proceso; índices de mezcla pueden estar limitando a gran escala.

Cuando se aísla el HA de fuentes animales, no existe ningún control sobre el PM inicial, es casi siempre de orden alto (>5Da). El HA fermentado a partir de microorganismos de tipo salvaje tiene más frecuentemente un PM inferior que el de fuentes animales, pero sigue siendo superior a 1 MDa.

Se ha citado frecuentemente que el HA de fermentaciones de Streptococcus de tipo salvaje tiene un peso molecular medio... [Seguir leyendo]

1. Método para la producción de un ácido hialurónico con un peso molecular promedio bajo mediante fermentación controlada de temperatura, incluyendo el método los pasos de: