Procedimiento y kit para la determinación de polifosfatos inorgánicos en plasma sanguíneo.

Procedimiento y kit para la determinación de polifosfatos inorgánicos en plasma sanguíneo

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Constituye un objeto de la presente invención un procedimiento para la determinación de los niveles de polifosfatos inorgánicos en el plasma sanguíneo. Este procedimiento comprende el empleo de la fracción del plasma crioprecipitado que concentra la mayoría de los polifosfatos y reduce la contaminación del fosfato libre en la muestra.

Constituye otro objeto de la presente invención un kit para la determinación de los polifosfatos en plasma sanguíneo.

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P201201137.

Solicitante: UNIVERSIDAD DE CADIZ.

Nacionalidad solicitante: España.

Inventor/es: RUIZ RODRIGUEZ,Felix Alejandro, MONTILLA RODRIGUEZ,Liliana Marcela.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/84 (en los que intervienen compuestos inorgánicos o el pH)

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Fragmento de la descripción:

PROCEDIMIENTO Y KIT PARA LA DETERMINACIÓN DE POLIFOSFATOS INORGÁNICOS EN PLASMA SANGUÍNEO.

OBJETO DE LA INVENCIÓN

Constituye un objeto de la presente invención un procedimiento para la determinación de los niveles de los polifosfatos inorgánicos en el plasma sanguíneo. Este procedimiento comprende el empleo de la fracción del plasma crioprecipitado, que concentra la mayoría del polifosfato y reduce la contaminación del fosfato libre en la muestra.

ESTADO DE LA TECNICA

Los polifosfatos inorgánicos (polyP) son polímeros de variado tamaño que están presentes en todos los seres vivos (Komberg, A., J Bacteríol, 1995, 177, 491-6). Como su nombre lo indica, los polyP están formados por más de tres residuos de fosfato, unidos entre sí por enlaces fosfoanhidro de alta energía (Figura 1A). (Komberg, A.,J Bacteríol, 1995, 177, 491-6).

En la industria los polyP han sido ampliamente usados en variadas aplicaciones que incluyen el procesamiento de alimentos, el uso como aditivo alimentario y la reducción de la dureza del agua, entre otros (Komberg, A., J Bacteríol, 1995, 177, 491-6).

En años recientes, muy variadas funciones han sido asociadas a los polyP relacionadas con la medicina por ejemplo la modulación de la proliferación celular (Wang, L., Fraley, C.D. y col., Proc Nati Acad Sci USA, 2003, 100, 11249-54), la angiogénesis (Han, K.Y., Hong, B.S. y col., Biochem J, 2007, 406, 49-55), la mineralización de los huesos (Schroder, H.C., Kurz, L. y col., Biochemistry (Mosc), 2000, 65, 296-303), el metabolismo energético (Pavlov, E., Aschar-Sobbi, R. y col., J Biol Chem, 285, 9420-8) y metástasis de tumores (Tammenkoski, M., Koivula, K. y col., Biochemistry, 2008, 47, 9707-13), entre otros. Se ha propuesto que los polyP

pueden ser utilizados para el tratamiento de enfermedades de las encías (Yamaoka, M., Uematsu, T. y col., Gerodontology, 2008, 25, 10-7), para estimular la regeneración de los huesos (Hacchou, Y., Uematsu, T. y col., JDent Res, 2007, 86, 893-7) y en la cicatrización de las heridas (Kim, H.R., Kim, H.Y. y col.),

En este sentido, nuestro grupo de investigación en el año 2004, describió que los polyP se acumulan en las plaquetas humanas y que son secretados por las plaquetas activadas en los procesos de coagulación de la sangre (Ruiz, F.A., Lea, C.R. y col., J Biol Chem, 2004, 279, 44250-7). A partir de ese momento, ha surgido un marcado interés por el estudio de las posibles funciones de los polyP relacionadas con la hematología. En consecuencia, se ha encontrado que los polifosfatos pueden modular la coagulación de la sangre tanto in vitro (Smith, S.A., Mutch, NJ. y col., Proc Nati Acad Sci USA, 2006, 103, 903-8) como in vivo (Muller, F., Mutch, N.J. y col., Cell, 2009, 139, 1143-56), y también, que incrementan la fibrinólisis (Smith, S.A. y Morrissey, J.H., Blood, 2008, 112, 2810-6). Por tanto se ha propuesto que los polyP pueden ser usados para promover la coagulación y disminuir el sangrado (Morrissey, J.H., Smith, S.A. y col., 2006, Patent US2006198837-A1; , 2010, Patent US 2010/0143492 Al; Smith, S.A. y Morrissey, J.H., 2010, Patent US2010/0297257 Al).

Estos estudios, han servido de origen a recientes descubrimientos acerca de funciones para de los polyP relacionadas con la inflamación. Los polyP estimulan la producción del péptido vasoactivo bradikinina, con la consecuente inducción de edemas (Muller, F., Mutch, N.J. et al., Cell, 2009, 139,1143-56). Los polyP también inducen una la respuesta inflamatoria mediada por el factor nuclear kappa beta en las células endoteliales (Bae, J.S., Lee, W. y col., J Thromb Haemost, 2012, 10, 1145-51). Más aún, nuestro grupo ha encontrado que las células de mastocitos y basófilos, determinantes en la inflamación y en los procesos de alergia, contienen estos polyP pro-inflamatorios en su granulos secretores (Moreno-Sanchez, D., Hemandez-Ruiz, L. y col., JBiol Chem, 2012,287,28435-44).

A pesar de la relevancia de los polyP en la coagulación y en la inflamación, los niveles presentes de este polímero en el plasma de la sangre no han podido ser determinados de manera precisa hasta el momento. Dependiendo los niveles encontrados dentro de las plaquetas, hasta ahora sólo se había estimado que debería estar en unos 3pM (Smith, S.A., Mutch, N.J. et al., Proc Nati Acad Sci USA, 2006, 103, 903-8). La invención que aquí se presenta permite, por primera vez, la estimación precisa de los polyP en el plasma.

Una de las razones que dificulta la medida de polyP en al plasma sanguíneo es la alta concentración de fosfato inorgánico presente (figura IB). Los niveles normales de fosfato en un adulto están entre 0,8 y l,45mM (2,5- 4.5 mg/dL) (Yu, A.S.L., Cecil Medidne, 2011, chap. 121), que son concentraciones 250-500 veces más altas que la estimadas para los polyP.

Recientemente se ha propuesto que algunas de las funciones del polyP en la sangre ocurren a través de su unión con las proteínas presentes en el plasma sanguíneo. Hasta el momento se ha descrito que los polyP se unen y afectan las actividades de las siguientes proteínas del plasma: factor XII (Muller, F., Mutch, N.J. et al., Cell, 2009, 139, 1143-56), fibrina y fibrinógeno (Smith, S.A. y Morrissey, J.H., Blood,

2008, 112, 2810-6; Mutch, N.J., Engel, R. y col., Blood, 2010, 115, 3980-8), trombina (Mutch, N.J., Myles, T. y col., J Thromb Haemost, 2010, 8, 548-55), Proteasa activadora de Factor VII (FSAP) (Muhl, L., Galuska, S.P. y col., Febs J,

2009, 276, 4828-39) y Factor von Willebrand (Montilla, M., Hemandez-Ruiz, L. y col., J Thromb Haemost, 2012).

Un procedimiento ampliamente usado para concentrar algunas de las proteínas del plasma, para donaciones, es la elaboración del crioprecipitado (EDQM, 2010) (figura IB). El crioprecipitado es un concentrado de proteínas de alto peso molecular que se forma cuando el plasma congelado es descongelado lentamente a temperaturas entre 1 a 6°C (Pool, J.G., Gershgold, E.J. y col., Nature, 1964, 203, 312). El concentrado contiene principalmente factor VIII (factor antihemolítico), factor von Willebrand, fibrinogeno, factor XIII, fibronectina, y pequeñas cantidades de otras proteínas del

plasma (Sparrow, R.L., Greening, D.W. y col., Methods Mol Biol, 2011, 728, 259- 65).

En el pasado, el crioprecipitado fue usado ampliamente para tratar pacientes con deficiencia del factor von Willebrand (Enfermedad de von Willebrand) o con deficiencia del factor VIII (Hemofilia A), pero en general el tratamiento de éstas patologías se ha ido remplazando por la transfusión de concentrados de los factores purificados (Yang, L., Stanworth, S. y col., Transfus Med, 2012, 22, 315-20). Actualmente, el uso del crioprecipitado es escaso, siendo común sólo para suplir el fibrinógeno en las coagulopatías específicas de los pacientes deficientes en esta proteína (hipofibrinogenemia), así como para tratar otras coagulopatías en los casos donde no se disponga de los factores del plasma aislados (Yang, L., Stanworth, S. et al., Transfus Med, 2012, 22, 315-20).

La invención que aquí se presenta está basada en el hallazgo de que la mayoría de los polyP presentes en el plasma de la sangre están unidos a las proteínas que se acumulan en la fracción del crioprecipitado (Figura 2A).

Referencias empleadas

ASCHAR-SOBBI, R. y col. High sensitivity, quantitative measurements of polyphosphate using a new DAPI-based approach. J Fluoresc, v. 18, n. 5, p. 859-66, Sep 2008.

AULT-RICHE, D. y col. Novel assay reveáis múltiple pathways regulating stress- induced accumulations of inorganic polyphosphate in Escherichia coli. J Bacteriol, v. 180, n. 7, p. 1841-7, Apr 1998.

BAE, J.S.; LEE, W.; REZAIE, A.R. Polyphosphate elicits pro-inflammatory responses that are counteracted by activated protein C in both... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1.- Procedimiento para la determinación del polifosfato en el plasma sanguíneo que incluye las siguientes etapas:

a) obtener una muestra biológica del individuo a determinar.

b) separar una fracción de la muestra, que contiene la mayoría del polifosfato.

c) determinar en dicha muestra el contenido de polifosfatos.

2.- Procedimiento para la determinación del polifosfato en el plasma sanguíneo según la reivindicación 1, caracterizado porque el individuo del que se obtiene la muestra biológica es un mamífero.

3.- Procedimiento para la determinación del polifosfato en el plasma sanguíneo según la reivindicación 2, caracterizado porque el mamífero del que se obtiene la muestra biológica es un humano.

4.- Procedimiento para la determinación del polifosfato en el plasma sanguíneo según las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque la muestra biológica incluye sangre.

5.- Procedimiento para la determinación del polifosfato en el plasma sanguíneo según las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque la muestra biológica incluye plasma.

6.- Procedimiento para la determinación del polifosfato en el plasma sanguíneo según la reivindicación 5, caracterizado porque cuando la muestra incluye plasma, el procedimiento comprende las siguientes etapas:

a) obtención de una muestra biológica del individuo a diagnosticar

b) aislamiento del plasma de los otros componentes de la muestra biológica

c) separación de la fracción de proteínas de alto peso molecular.

d) separación del polifosfato inorgánico del resto de componentes de la fracción.

e) determinación cuantitativa del polifosfato solubilizado y separado en las etapas anteriores.

7.- Procedimiento para la determinación del polifosfato en el plasma sanguíneo según la reivindicación 6, caracterizado porque la etapa de aislamiento del plasma se lleva a cabo mediante un proceso de centrifugación simple.

8.- Procedimiento para la determinación del polifosfato en el plasma sanguíneo según las reivindicaciones 6 y 7, caracterizado porque la separación de las proteínas de alto peso molecular se realiza mediante la congelación y descongelación lenta del plasma y posterior centrifugación simple (crioprecipitado).

9.- Procedimiento para la determinación del polifosfato en el plasma sanguíneo según las reivindicaciones 6-8, caracterizado porque la separación del polifosfato se realiza por extracción con soluciones de fenol/cloroformo, o bien mediante la precipitación de las proteínas en un ácido fuerte como ácido perclórico o ácido tricloroacético.

10.- Procedimiento para la determinación del polifosfato en el plasma sanguíneo según las reivindicaciones 6-9, caracterizado porque la separación del polifosfato solubilizado se lleva a cabo mediante centrifugación.

11.- Procedimiento para la determinación del polifosfato en el plasma sanguíneo según las reivindicaciones 6-10, caracterizado porque la determinación cuantitativa del polifosfato solubilizado y separado en las etapas anteriores se efectúa, tras neutralización con solución alcalina, directamente mediante colorimetría o fluorimetría, preferentemente colorimetría.

12.- Procedimiento para la determinación del polifosfato en el plasma sanguíneo según las reivindicaciones 6-10, caracterizado porque la determinación cuantitativa del polifosfato y solubilizado y separado en las etapas anteriores incluye tras la neutralización con solución alcalina

a) un ataque enzimático para procesar el polifosfato, para liberar los productos resultantes de dicha reacción enzimática.

b) determinación cuantitativa de alguno de los productos resultantes de la reacción enzimática mediante colorimetría o por luminiscencia, preferentemente mediante colorimetría.

13.- Kit para la determinación del polifosfato en el plasma sanguíneo mediante un procedimiento según las reivindicaciones 1-12, caracterizado porque incluye:

- medios para aislar la fracción de crioprecipitado del plasma.

- medios para la separación, detección y cuantificación del polifosfato.

- muestras de control de polifosfato y/o plasma para comparar con los valores obtenidos.

14.- Kit para la determinación del polifosfato en el plasma sanguíneo según la reivindicación 13, caracterizado porque incluye adicionalmente enzimas para el procesamiento específico de polifosfato en productos detectables mediante colorimetría o por luminiscencia.

15.- Kit para la determinación del polifosfato en el plasma sanguíneo según las reivindicaciones 13 y 14, caracterizado porque los medios para producir extractos acídicos de las proteínas del crioprecipitado son ácidos que se seleccionan entre

ácido perclórico o ácido tricloroacético.

16.- Kit para la determinación del polifosfato en el plasma sanguíneo según las reivindicaciones 13 - 15, caracterizado porque los medios para la detección y cuantifícación del polifosfato son reactivos para ensayos colorímétricos, de

fluorescencia o de luminiscencia, preferentemente reactivos colorimétricos que se seleccionan entre colorantes básicos como el azul de toulidina o fluoróforos como Fura-2 o DAPI.

17.- Kit para la determinación del polifosfato en el plasma sanguíneo según las 15 reivindicaciones 14 - 16, caracterizado porque las enzimas se seleccionan entre las

exopolifosafatasas, la polifosfato kinasas, o la polifosfato glucokinasas.