Nuevos genotipos del nucleopoliedrovirus simple de Chrysodeixis chalcites (ChchSNPV), procedimiento para su producción y uso como agente de control biológico.

Nuevos genotipos del nucleopoliedrovirus simple de Chrysodeixis chalcites (ChchSNPV)

, procedimiento para su producción y uso como agente de control biológico. Se describen tres nuevos genotipos del nucleopoliedrovirus de Chrysodeixis chalcites, ChchSNPV, purificados de un mismo aislado de las Islas Canarias. Cada uno de los genotipos tiene una actividad insecticida específica frente a larvas de ChchSNPV comparable a la de los insecticidas biológicos habituales. Además, la mezcla de los tres genotipos, particularmente en proporción 36:26:14, ya sea en forma de poliedros de un único genotipo o con viriones co-ocluidos de genotipos mezclados, es capaz de controlar las plagas de ChchSNPV en platanera de forma más eficiente que los insecticidas habituales, químicos o biológicos, siendo de los nucleopoliedrovirus más activos de los desarrollos como bioinsecticidas. Su uso como insecticida representa una tecnología segura para los vertebrados por ser específicos de invertebrados. Además, pueden producirse con facilidad y buen rendimiento por inoculación oral de larvas de C. chalcites con poliedros de ChchSNPV.

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P201330487.

Solicitante: UNIVERSIDAD PUBLICA DE NAVARRA.

Nacionalidad solicitante: España.

Inventor/es: CABALLERO MURILLO,PRIMITIVO, WILLIAMS,TREVOR, BERNAL RODRÍGUEZ,Alexandra, SIMÓN DE GOÑI,Ohiane, CARNERO HERNÁNDEZ,Aurelio, HERNÁNDEZ SUÁREZ,Estrella Marina.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA > CONSERVACION DE CUERPOS HUMANOS O ANIMALES O DE VEGETALES... > A01N63/00 (Biocidas, productos que repelen o atraen a los animales perjudiciales, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos, virus, hongos microscópicos, animales, p. ej. nematodos, o sustancias producidas por, u obtenidas a partir de microorganismos, virus, hongos microscópicos o animales, p.ej. encimas o productos de fermentación (que contienen compuestos de constitución determinada A01N 27/00 - A01N 59/00))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Virus, p. ej. bacteriófagos; Composiciones que los... > C12N7/02 (Aislamiento o purificación)

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Fragmento de la descripción:

Nuevos genotipos del nucleopoliedrovirus simple de Chrysodeixis chalcites (ChchSNPV), procedimiento para su producción y uso como agente de control biológico

Campo de la invención

La invención se adscribe al sector técnico de los plaguicidas biológicos de aplicación al control de plagas de insectos. Concretamente, la invención se refiere a tres nuevos genotipos de un nucleopoliedovirus que es capaz de infectar a las larvas del lepidóptero Chrysodeixis chalcites, a composiciones que comprenden uno o varios de dichos nuevos genotipos, a un procedimiento para su producción y su uso para el control de plagas del mencionado insecto.

Antecedentes de la invención

Los baculovirus (Baculoviridae) son una familia de virus que infectan específicamente a invertebrados y que se han aislado de numerosas especies fitófagas, entre las que se encuentran muchas de las más importantes plagas de insectos, principalmente del orden Lepidoptera. Presentan un genoma de DNA de doble cadena, empaquetado en una cápsida proteica, formando la nucleocápsida. Durante la replicación del virus, la nucleocápsida adquiere una envuelta trilaminar compuesta por una capa de proteínas entre dos de lípidos (Caballero et al., 2001). Algunas nucleocápsidas permanecen en la misma célula en la que han sido formadas, donde adquieren una membrana sintetizada de novo, dando lugar a los viriones derivados de los cuerpos de inclusión (ODV; occlusion derived virus) que quedan después incluidos en una matriz proteica formando el poliedro. Otras nucleocápsidas, una vez han sido sintetizadas, se mueven y abandonan la célula huésped. En este caso, la nucleocápsida adquiere la membrana a partir de la membrana del citoplasma de la célula huésped cuando atraviesa por puntos concretos donde se encuentra insertada una glicoproteina codificada por el virus (GP64 o proteína F dependiendo del virus). A estos viriones se les denomina viriones brotados (BV; budded virus) y se encuentran libres en la cavidad hemocélica del huésped, propagando la infección a los distintos tejidos. Así, puede decirse que los baculovirus presentan dos tipos de viriones o partículas víricas morfológicamente completas e infectivas: los viriones derivados de los cuerpos de inclusión (ODV), que son los responsables de la infección primaria en el tubo digestivo, y los viriones brotados (BV) que son los responsables de la infección secundaria propagándolas a todos los órganos y tejidos de la cavidad hemocélica que son susceptibles (Fig. 1A).

Morfológicamente, los ODVs pueden ser de dos tipos distintos; los denominados simples (SNPV; single nucleopolyhedrovirus) que contienen una única nucleocápsida por virión o los de tipo múltiple (MNPV; múltiple nucleopolyhedrovirus) que contienen un número variable de nucleocápsidas por virión (Fig. 1B). Los ODVs, presentes en todos los baculovirus conocidos, son los elementos infecciosos responsables de la transmisión del virus entre los individuos susceptibles, así como del comienzo de la infección primaria en las células epiteliales del mesenterón. Los BVs por su parte contienen una sola nucleocápsida y son todos morfológicamente iguales. Estos viriones, son los elementos infecciosos responsables de diseminar la infección entre los órganos y tejidos de la cavidad hemocélica del huésped, así como en los cultivos celulares in vitro (Caballero et al., 2001).

Al final del proceso infeccioso todos los baculovirus sintetizan grandes cantidades de poliedrina (en el caso de los nucleopoliedrovirus, NPVs) o granulina (granulovirus, GVs), las cuales cristalizan formando una matriz o cuerpo de inclusión (OB; occlusion body) con forma de poliedro irregular (poliedrina) o de gránulo (granulina). En los poliedros o NPVs quedan incluidos varios viriones ODV mientras que en el gránulo o GVs solamente uno. Esta matriz permite preservar la capacidad infecciosa de estos virus fuera del huésped, ya que los OBs son insolubles en agua, resistentes a la putrefacción y desintegración por agentes químicos y también a tratamientos físicos como la congelación, la desecación o liofilización, características que les confieren persistencia en el medio. En cambio, los OBs son solubles en soluciones alcalinas, como las que se producen en el tubo digestivo de algunos insectos (pH 9-11), lo que facilita la liberación de viriones ODVs de los OBs para que pueda iniciar la infección (Caballero et al., 2001).

Antiguamente, la familia Baculoviridae se dividía en dos grupos o géneros en función de la morfología de los cuerpos de inclusión; Nucleopolyhedrovirus (NPV) con cuerpos de inclusión de forma poliédrica y Granulovirus (GV) con forma granular. Sin embargo, desde 2006 la clasificación se basa en el análisis filogenético de los genomas de estos virus (Jehle et al., 2006), y se pueden diferenciar 4 géneros dependiendo de la especie huésped a la que infectan; los Alphabaculovirus son NPVs específicos de lepidóperos, los Betabaculovirus GVs que infectan lepidópteros, los Gammabaculovirus NPVs específicos de himenópteros y finalmente Deltabaculovirus NPVs infectivos de dípteros.

Las poblaciones de baculovirus naturales muestran una gran heterogeneidad genética. Esta diversidad se ha demostrado tanto en la caracterización de diferentes aislados geográficos del mismo virus como en los aislados en sí, cada uno de los cuales comprende frecuentemente distintas variantes genotípicas. El análisis del DNA viral con

enzimas de restricción ha demostrado ser un método muy útil para diferenciar y caracterizar aislados y genotipos presentes en un mismo aislado, pues proporciona perfiles que son característicos de cada aislado o genotipo (Erlandson et al., 2007; Harrison y Bonning, 1999; Figueiredo et al., 1999).

Los aislados estrechamente relacionados habitualmente no muestran grandes diferencias fenotípicas en términos de sus características insecticidas, aunque ocasionalmente cambios mínimos en el genoma de estas variantes pueden afectar rasgos biológicos importantes tales como la cantidad de inoculo necesario para matar a un porcentaje de la población (patogenenicidad), velocidad con la que se mata al insecto (tiempo medio de mortalidad, TMM), rendimiento en cuerpos de oclusión (producción OBs), o incluso el espectro de huésped, tamaño de los cuerpos de oclusión y licuefacción de las larvas (Cory et al., 2005; Harrison et al., 2012). También se ha observado que el origen geográfico del virus y el hospedador pueden afectar a las curvas de dosis-mortalidad y el período de supervivencia del hospedador infectado (Erlandson, 2009; Erlandson et al., 2007).

Chrysodeixis chalcites (descrita inicialmente por Esper en 1789) es un lepidóptero de la familia Noctuidae cuyos miembros se suelen denominar noctuidos en la literatura científica y cuyas larvas son unas orugas eruciformes: con cuerpo cilindrico, cabeza bien desarrollada y falsas patas abdominales. Esta polilla está considerada como una de las plagas polífagas más importantes en muchos países, principalmente del Sur de Europa, África, Oceanía, Asia y algunas zonas de América. Sus orugas se alimentan sobre muchas especies de plantas entre las que se encuentran cultivos ornamentales, hortícolas, industriales y también plantas sin interés comercial. En Holanda, afecta principalmente a tomates, pimientos y crisantemos en los invernaderos. En el territorio continental de España, causa daños de importancia económica en el Valle del Guadalquivir, la Vega de Granada y en invernaderos de la provincia de Almería. En las Islas Canarias (que pertenecen a España pero están situadas frente a la costa de África, a unos 100 km de Marruecos), las poblaciones de estas mariposas nocturnas o polillas han experimentado un marcado crecimiento durante la última década, con lo que las infestaciones... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un nucleopoliedrovirus simple de Chrysodeixis chalcites (ChchSNPV) caracterizado por pertenecer a un genotipo seleccionado del grupo de:

i) los ChchSNPV depositados en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) con los números de depósito CNCM I-4690 (ChchTF1-A), CNCM I-4620 (ChchTF1-B), CNCM I-4621 (ChchTF1-C), o

ii) los genotipos cuyo genoma tiene la secuencia de SEQ ID NO: 17 (ChchTF1- A), SEQ ID NO: 18 (ChchTF1-B) o SEQ ID NO: 19 (ChchTF1-C).

2. Nucleopoliedrovirus simple aislado según la reivindicación 1, que está en forma de:

a) partícula vírica completa (virión)

b) poliedro.

3. Un poliedro que contiene varios viriones, en el que al menos uno de los viriones pertenecen a un genotipo del nucleopoliedrovirus simple de Chrysoideixis chalcites seleccionado del grupo de ChchTF1-A (CNCM I-4690), ChchTF1-B (CNCM I-4620) y ChchTF1-C (CNCM I-4621).

4. Poliedro según la reivindicación 3, que contiene viriones de genotipos diferentes.

5. Poliedro según la reivindicación 3, que contiene viriones de un solo genotipo seleccionado del grupo de ChchTF1-A (CNCM I-4690), ChchTF1-B (CNCM I-4620) y ChchTF1-C (CNCM I-4621).

6. Poliedro según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, que contiene viriones en los que el genoma de al menos uno de dichos viriones comprende un fragmento de DNA cuya secuencia es la de SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 ó SEQ ID NO:7.

7. Poliedro según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, que contiene viriones en los que el genoma de al menos uno de dichos viriones comprende un fragmento de DNA cuya secuencia es la de SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 ó SEQ ID NO:10.

8. Poliedro según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, que contiene viriones en los que el genoma de al menos uno de dichos viriones comprende un fragmento de DNA cuya secuencia es la de SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO:12 ó SEQ ID NO:13.

9. Poliedro según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, que contiene viriones en los que el genoma de al menos uno de dichos viriones comprende un fragmento de DNA cuya secuencia es la de SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15 ó SEQ ID NO:16.

10. Una composición que comprende al menos un nucleopoliedrovirus de una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 o al menos un poliedro de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 9.

11. Composición según la reivindicación 10, en la que los nucleopoliedrovirus están en forma de poliedro.

12. Composición según la reivindicación 10 ó 11, que comprende poliedros que contienen viriones co-ocluidos, y en la que los viriones co-ocluidos en un mismo nucleopoliedrovirus pertenecen al mismo genotipo o a genotipos diferentes.

13. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, que comprende una mezcla de viriones de los genotipos:

i) ChchTF1-A (CNCM I-4690) y ChchTF1-B (CNCM I-4620),

ii) ChchTF1-A (CNCM I-4690) y ChchTF1-C (CNCM 1-4621),

iii) ChchTF1-B (CNCM I-4620) y ChchTF1-C (CNCM 1-4621), o

iv) ChchTF1-A (CNCM I-4690), ChchTF1-B (CNCM I-4620) y ChchTF1-C

(CNCM 1-4621).

14. Composición según la reivindicación 13, en la que los genotipos ChchTF1-A (CNCM I-4690), ChchTF1-B (CNCM I-4620) y ChchTF1-C (CNCM 1-4621) están en la proporción ChchTF1-A : ChchTF1-B : ChchTF1-C 36:26:14.

15. Composición según la reivindicación 14, en la que los viriones están en forma de poliedros que contienen viriones co-ocluidos, y en la que los viriones co-ocluidos en un mismo nucleopoliedrovirus pertenecen al mismo genotipo o a genotipos diferentes.

16. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, que adicionalmente contiene un excipiente o vehículo apropiado en el sector agrícola.

17. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 16, que está en forma acuosa.

18. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 16, que está en forma sólida.

19. Composición según la reivindicación 16, para ser aplicada por un método

seleccionado entre pulverización a nivel de tierra, pulverización aérea, aplicación en disolución, aplicación en forma de polvo, riego o irrigación.

20. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, en la que los nucleopoliedrovirus simples de Chrysodeixis chalcites están mezclados con un abono, un fertilizante o un plaguicida.

21. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, que

adicionalmente comprende un agente potenciador del efecto del nucleopoliedrovirus sobre Chrysodeixis chalcites.

22. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 21, que

adicionalmente comprende un insecticida basado en la bacteria Bacillus thuringiensis seleccionado entre endosporas de dicha bacterias, cristales de proteínas Cry o mezclas de los mismos.

23. Un procedimiento para la producción de poliedros de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 10, que comprende una etapa en la que se alimentan larvas de Chysodeixis chalcites mediante una dieta artificial que comprende poliedros del nucleopoliedrovirus de C. chalcites que contienen viriones de uno cualquiera de los genotipos ChchTF1-A (CNCM I-4690), ChchTF1-B (CNCM I-4620) y ChchTF1-C (CNCM I-4621) o mezclas de los mismos.

24. Procedimiento según la reivindicación 23, que comprende las etapas de:

a) alimentar larvas de Chysodeixis chalcites con una dieta artificial que comprende poliedros del nucleopoliedrovirus de C. chalcites que contienen

viriones de uno cualquiera de los genotipos ChchTF1-A (CNCM I-4690), ChchTF1-B (CNCM I-4620) y ChchTF1-C (CNCM 1-4621) o mezclas de los mismos;

b) mantener las larvas a 25-28°C hasta que se produce su muerte;

c) purificar los poliedros generados en las larvas triturando los cadáveres de las larvas en agua, filtrando la suspensión resultante, precipitando los poliedros, lavando el precipitado y volviendo a precipitarlos;

d) resuspender el precipitado final en agua a pH neutro;

e) opcionalmente, almacenar la suspensión obtenida en una de las siguientes condiciones:

i. a temperatura ambiente

ii. en refrigeración (entre 0°C y 4°C)

iii. liofilizar la suspensión y conservarla a temperatura ambiente.

25. Procedimiento según la reivindicación 23 ó 24, en el que la dieta artificial que recibe cada larva se suministra:

a) como suspensión acuosa en forma de gotas, opcionalmente con sacarosa al 10%, en la que se encuentran suspendidos los poliedros y que, preferiblemente, contiene también un colorante;

b) en forma sólida, mediante pastillas que contienen, adicionalmente a los poliedros del nucleopoliedrovirus de Chrysodeixis chalates: 5% germen de trigo, 5% harina de soja, 5% levadura de cerveza, 1,5% agar, 1,3% azúcar, 1% sales mixtas, 0,5% celulosa, 0,45% ácido ascórbico, 0,4% ácido sórbico, 0,18% nipagina, 0,18% ácido benzoico, 0,14% aceite de germen de trigo, 0,094% cloruro de colina, 0,05% cloranfenicol, 0,009% vitaminas y 80% agua destilada; o

c) inicialmente como suspensión acuosa en forma de gotas como en el apartado a) y posteriormente en forma de gotas como en el apartado b).

26. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25, en el que las larvas de C. chalcites son larvas del sexto estadio.

27. Procedimiento según la reivindicación 26, en el que las larvas son inoculadas 24 horas después de haber mudado al sexto estadio (L6).

28. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 27, en el que los poliedros con los que se alimentan las larvas están a una concentración del rango de 2,00 x 107 a 1,00 x 109 poliedros/ml.

29. Procedimiento según la reivindicación 28, en el que la concentración es de 9,08 x 108 poliedros/ml.

30. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 29, en el que se utilizan de 1 a 200 larvas en un recipiente de 1,5 litros de volumen.

31. Procedimiento según la reivindicación 30, en el que se utilizan 150 larvas en un recipiente de 1,5 litros de volumen.

32. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 31, en el que se utilizan recipientes de 1,5 litros de volumen que contienen 150 larvas de C. chalcites inoculadas 24 h después de haber mudado al sexto estadio y en el que las larvas se infectan con poliedros a una concentración de 9,08 x 108 poliedros/ml.

33. Un método para identificar en una muestra la presencia de un nucleopoliedrovirus simple de C. chalcites de un genotipo seleccionado entre ChchTF1-A (CNCM I-4690), ChchTF1-B (CNCM I-4620) y ChchTF1-C (CNCM I-4621), comprende las etapas de:

a) amplificar mediante PCR el DNA extraído de dicha muestra utilizando una pareja de cebadores que se selecciona entre las formadas por:

i) SEQ ID NO:1 (F-Hoar) y SEQ ID NO:2 (R-Hoar), o

ii) SEQ ID NO:3 (F-Brod) y SEQ ID NO:4 (R-Brod);

b) analizar el fragmento amplificado para determinar su tamaño o su secuencia;

c) concluir que está presente uno de los genotipos ChchTF1-A (CNCM I-4690), ChchTF1-B (CNCM I-4620) o ChchTF1-C (CNCM I-4621) si:

i) el fragmento amplificado por la pareja de SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2 tiene

a. un tamaño de 756 (ChchTF1-A (CNCM I-4690)), 921 (ChchTF1-B) ó 651 (ChchTF1-C) nucleótidos, respectivamente; o

b. la secuencia de SEQ ID NO:5 (ChchTF1-A), SEQ ID NO:6 (ChchTF1-B)

o SEQ ID NO:7 (ChchTF1-C), respectivamente o, alternativamente,

ii) el fragmento amplificado por la pareja de SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4 tiene

a. un tamaño de 1.743 (ChchTF1-A), 962 (ChchTF1-B) ó 1.725 nucleótidos

(ChchTF1-C), respectivamente; o

b. la secuencia de SEQ ID NO:8 (ChchTF1-A), SEQ ID NO:9 (ChchTF1-B)

o SEQ ID NO: 10 (ChchTF1-C), respectivamente.

34. Uso de una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 22 como insecticida.

35. Uso según la reivindicación 34, para controlar plagas de C. chalcites.

36. Uso según la reivindicación 34, para controlar plagas de una polilla de la familia Noctuidae seleccionada entre las especies Trichoplusia ni y Plusia gamma.

37. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 34 a 36, como insecticida para plantas.

38. Uso según la reivindicación 37, en el que la planta se selecciona entre tomate o plátano.

39. Uso según la reivindicación 38, en invernaderos o en cultivos al aire libre.

40. Uso según la reivindicación 38, para cultivos de platanera.

41. Uso según la reivindicación 40, en el que la dosis es de entre 105 y 109 poliedros/ml.

42. Uso según la reivindicación 34, para controlar plagas de C. chalcites en cultivos de platanera en las Islas Canarias.