Monitorización mediante TAC de procesos de preservación en frío y criopreservación de material biológico.

La invención objeto de la presente memoria se refiere al uso novedoso de la tomografía axial computarizada

(TAC) para la monitorización de procesos de preservación en frío y criopreservación de material biológico. El uso del TAC permite mejorar significativamente dichos procesos debido a su capacidad de detección de la concentración de crioprotector en los procesos de criopreservación y detección de la formación de hielo en muestras biológicas.

La presente invención se enmarca dentro del sector de la investigación o análisis de materiales por determinación de sus propiedades químicas o físicas, y dentro de éste, es de interés tanto en la conservación convencional de alimentos, como en criopreservación de material biológico de todo tipo (tanto en congelación lenta, vitrificación rápida u otros).

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P201300685.

Solicitante: UNIVERSIDAD DE SEVILLA.

Nacionalidad solicitante: España.

Inventor/es: RISCO DELGADO,RAMON, OLMO FERNANDEZ,ALBERTO, CORRAL SOUSA,Ariadna, BALCERZYK,Marcin, REGALADO LAMPREA,David, COBOS SABATÉ,Joaquín.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA > CONSERVACION DE CUERPOS HUMANOS O ANIMALES O DE VEGETALES... > Conservación de cuerpos humanos o animales, o partes... > A01N1/02 (Conservación de partes vivas)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > DIAGNOSTICO; CIRUGIA; IDENTIFICACION (análisis de... > Aparatos de diagnóstico por radiación, p. ej. combinados... > A61B6/03 (Tomografía computerizada (ecotomografía A61B 8/14))

PDF original: ES-2529265_A1.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Monitorización mediante TAC de procesos de preservación en frio y criopreservación de malerial biológico Objeto de la Invención la invención objeto de la presente memoria se refiere al uso novedoso de la tomagrafla axial computarizada (TAC) para la monitorización de procesos de preservación en fria y criopreservación de material biológico. El uso del TAC permite mejorar significativamente dichos procesos debido a su capacidad de detección de la concentración de crioprotector en los procesos de criopreservación y detección de la formación de hielo en muestras biológicas. La presente invención se enmarca dentro del sector de la investigación o análisis de materiales por determinación de sus propiedades químicas o flsicas, y dentro de éste, es de interés tanto en la conservación convencional de alimentos, como en criopreservación de material biológico de todo tipo (tanto en congelación lenta, vitrificación rápida u otros) .

Estado de la técnica El almacenamiento de material biológico (células, tejidos, etc.) juega un papel esencial dentro de muchas parcelas de la actividad humana: agricultura (semillas) y ganaderia (semen) , trasplantes (piel, cómeas, huesos, válvulas, órganos) , Injertos, tejidos artificiales, sangre, medicamentos, material reproductor en casos de infertilidad, alimentos, etc. Las principales técnicas empleadas para conseguir la conservación del material biológico se basan en la utilización de bajas temperaturas para ralentizar y detener las reacciones químicas responsables del envejecimiento y deterioro celular.

El almacenamiento a largo plazo requiere de muy bajas temperaturas. típicamente entre -1400C y -1800c. La aparición de hielo durante la preservación y criopreservación es un problema, ya sea intracelular, causando danos irreparables en los distintos orgénulos celulares, o extra-celular, rompiendo y desestructurando el tejido u órgano en cuestión. Para evitar la fonnación de hielo suelen utilizarse los agentes crioprotectores, aunque una concentración elevada de éstos supone un problema igualmente grave para la supervivencia celular.

En el caso de células aisladas, existen dos técnicas que consiguen la criopreservación de forma satisfactoria: el enfriamiento lento y la vitrificación. El enfriamiento lento es hasta ahora el procedimiento más usado. Se basa en el control de la tasa de enfriamiento, y por tanto del ritmo de crecimiento de hielo extracelular con el objetivo de crear un delicado equilibrio entre los distintos factores que causan daflo celular, entre los que se encuentran la formación de hielo intracelular, fracturas y una excesiva deshidratación de la célula . La vitrificación es un proceso mediante el cual un liquido se solidifica en una fase no cristalina (fase vItrea) con un rápido descenso de la temperatura y un aumento en la viscosidad. La vitrificación elimina completamente la formación de cristales de hielo, mejorando en gran medida los resultados obtenidos por el enfriamiento lento para determinados tipos celulares diflciles de criopreservar.

En lo que se refiere a la conservación de tejidos y órganos, los prinCipios de conservación en fria son los mismos que los aplicables al caso de células aisladas. Sin embargo, aqui el problema es mucho más complejo, debido sobre todo al mayor tamaflo de la muestra, lo que dificulta la transferencia de masa (crioprotector) y calor (frio) .

En 1957 se perfunde por primera vez un órgano de mamllero con glicerol, enfriado y preservado a _20°C, en un trabajo publicado por Audrey Smith (ASmijh, 1957)

[1}. En estos experimentos pioneros un corazón de hámster fue perfundido con 2M

de glicerol y expuesto a _20°C. Tras el recalentamiento y lavado del crioprotector, algunas contracciones débiles podlan apreciarse en el órgano, pero el

funcionamiento de éste estaba todavia bastante lejos del deseado.

En el a~o 1965, Farrant y Huggins [2]. ambos de manera Independiente, idearon un nuevo camino hacia la criopreservación de órganos que involucraba una fuerte supresión o incluso total eliminación de la formación de hielo, sin la necesidad de un enfriamiento rápido. El método de Farrant consistfa en ir aumentando la concentración del agente crioprotector a la vez que enfriando en múltiples pasos, de manera que la muestra siempre estuviera sobre la curva del punto de fusión del diagrama de fases ternario del sistema DMSO-agua-NaCI. En sus experimentos Farrant utilizó tejido de músculo liso de útero de conejo. las muestras fueron almacenadas a -79'C utilizando DMSO como agente crioprotector. La adición de las soluciones crioprotectoras durante el enfriamiento y calentamiento fueron temperaturas, siempre probando la toxicidad en riñones de conejo. Una de sus soluciones vitrificantes con mejores resultados es la denominada M22, donde el número hace referencia a la conveniencia de incubar los rinones con esta solución a -22' C (Fahy et al, 2004) [6]. En un reciente trabajo (Fahy at .1. 2009) (7J. Fahy presentó los resultados de un rir'\6n de conejo vitrificado que fue posteriormente trasplantado sin presentar rechazo alguno y con evidencias de funcionalidad.

En cualquier caso, ya sea con la utilización de los crioprotectores presentados por

Fahy, con el método de Liquidus-Tracking de Pegg, o como parte de otros protocolos de criopreservación, conocer la concentración de crioprotector durante el proceso de enfriamiento es muy importante, ya que nos proporciona información fundamental para optimizar dichos protocolos, ajustando los tiempos de peñusión y minimizando de esta forma tanto la toxicidad causada por el crioprotector como la posibilidad de formación de hielo. De igual forma , obtener información acerca de la eventual formación de hielo en el órgano es fundamental, al ser los da~os producidos por éste uno de los mayores problemas a solucionar para conseguir la correcta criopreservación (Pegg 2006) [3, 4, 5J.

Diferentes métodos han sido desarrollados con el fin de poder monitorizar la concentración de crioprotector junto a la temperatura. Dr. Pegg, en su trabajo de criopreservación de cartllago, comenzó midiendo la concentración de crioprotector

basándose en el trabajo de Elford de 1969 [8J, que muestra que cuando una pieza de tejido es sumergida en una solución de crioprotector, los tiempos de cambio de peso sumergida pueden ser usados para monitorizar el proceso de permeación de crioprotector en el tejido.

En 2007, Dr. Pegg (Pegg 2007) [9J mejoro su medida de crioprotector mediante volumetrra y cromatografla. Para determinar el contenido de agua usó la reacción de Kar1 Fischer (KF) . Colocaba el tejido en un exceso de reactivo KF y, una vez que toda el agua habla reaccionado, el exceso era valorado con una solución conocida de agua en metanol. Cada dia estandarizaba el sistema at'iadiendo una cantidad conocida de agua, sobre 10 mg, al mismo volumen de reactivo de KF. El

contenido de DMSO se medía mediante HPLC (High Pressure Liquid Cromatography) . Los datos eran expresados en términos del peso de tejido y la concentración del CPA venía dada por la siguiente fórmula:

peso.normalizado.Me]SOxl00

------~~~--------~--~--~~~~wlw

peso.nonnalizado.agua + peso.normalizado.MelSa Fuller (Fuller, Busza and Proctor 1989) {10] utilizó técnicas de resonancia nuclear magnética (NMR) para la medida de concentración de crioprotector en hlgado de rata y Taylor y Busza (1992) {11] para la medida en cómea. Poco después, en 1994, Bateson {12] y su grupo usaron el NMR para medir la concentración de DMSO al penetrar en la arteria carótida de un conejo.

Este método ha sido también utilizado con otros crioprotectores, por ejemplo por Po-Wah y Fuller en 2001 (Fuller, Takahashi and HurreIl2001) {13] para determinar... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Monitorización de procesos de preservación en frío y criopreservación de

5 material biológico, caracterizado porque la presencia de hielo y la

concentración de dimetil sulfóxido como crioprotector son detectadas con

un micro-TACo

10 2. Monitorización de procesos de preservación en frío y criopreservación

según la reivindicación 1, basado en la medida de la pérdida de inlensidad

de rayos X a través de distintas direcciones en el objeto, por lo que el

factor de atenuación permite determinar la concentración de crioprotector

en el material biológico.

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3. Procedimiento de monitorización de procesos de preservación en frío y

criopreservación según reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque la

fuente de rayos X tiene un voltaje de aceleración bajo, desde 45 hasta 75

20 kV, usando preferentemente 65 o 75 kV, en el que se realizan 360

proyecciones de rayos X alrededor de 360°, con un tiempo de exposición

de entre 500 y 1500 ms y una resolución espacial de 200 micras, pudiendo

aumentarse la resolución hasta 100 Y 50 micras.

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4. Monitorización de procesos de preservación en frío y criopreservación de

material biológico, según las reivindicaciones 1, 2 Y 3, caracterizado por el

uso de dimetil sulfóxido como agente crioprotector.

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