Microorganismo recombinante y procedimiento para producir L-lisina.

ADN recombinante replicable de un modo autónomo en una bacteria Escherichia coli, en el que el ADN recombinante comprende un gen dapA de B. subtilis y en el que el gen dapA presenta una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos por lo menos idéntica en un 90 % a la SEC ID n.º: 2, y en el que se sustituye el aminoácido histidina de la posición 119 con tirosina, presentando dicha proteína actividad de dihidrodipicolinatosintasa

(DDPS).

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/CN2009/000215.

Solicitante: Global Bio-Chem Technology Group Company Limited.

Nacionalidad solicitante: China.

Dirección: Unit 1104, Admiralty Centre, Tower 1 18 Harcourt Road Hong Kong CHINA.

Inventor/es: HUANG, HE, YANG,SHENG, WANG,DEHUI.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/31 (Genes que codifican proteínas microbianas, p. ej. enterotoxinas)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/70 (Vectores o sistemas de expresión especialmente adaptados a E. coli)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que... > C12N1/21 (modificados por la introducción de material genético extraño)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > SISTEMA DE INDEXACION ASOCIADO A LAS SUBCLASES C12C... > Microorganismos > C12R1/19 (Escherichia coli)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN... > Preparación de compuestos orgánicos que contienen... > C12P13/08 (Lisina; Acido diaminopimélico; Treonina; Valina)

PDF original: ES-2510865_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Microorganismo recombinante y procedimiento para producir L-lisina CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al campo de la biotecnología. En particular, la presente invención proporciona procedimientos para producir L-lisina mediante la proliferación de una bacteria Escherichia transformada, en particular E. coli, que comprende un gen dapA natural o variante de Bacillussubtilis, que se describen en la presente memoria.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La L-lisina es un aminoácido esencial que no se sintetiza en los animales. Se ha descubierto que muchas cepas bacterianas naturales y mutantes producen L-lisina. Al utilizarse ampliamente como suplemento alimenticio, medicamento, producto químico e ingrediente alimentario, se ha producido la L-lisina por fermentación a gran escala utilizando principalmente una bacteria Cor y neform o una bacteria Escherichia.

En la mayoría de las bacterias, la L-lisina se sintetiza de un modo natural a partir de aspartato en una vía enzimática de nueve etapas, entre ellas dos etapas compartidas por las vías de biosíntesis de la metionina y la treonina (Anastassiadis, S., RecentpatentsonBiotechnology 2007, 1 (1) :11-24; Chen, N. et al., J. Biol. Chem. 1993, 268 (13) :9448-66) . Por ejemplo, la dihidrodipicolinatosintasa ("DDPS") , una enzima que cataliza la primera etapa en la rama de la biosíntesis de la lisina, experimenta una autorregulación negativa por la L-lisina en bacterias gramnegativas (por ejemplo, E. coli, Bacillussphaericus y Methanobacteriumthermoautotrophicum) , pero no en las bacterias grampositivas (por ejemplo Bacilluslicheniformis, Bacillusmegaterium, Bacillussubtilis, Cor y nebacteriumglutamicum, Bacilluscereus, y Bacilluslactofermentum) (Dobson, R. et al., Acta Cr y st. 2005, D61:1116-24) . Además, la regulación de la ruta de la biosíntesis de la lisina en Bacillussubtilis ("B. subtilis") es única porque implica una regulación doble mediante la lisina y uno de sus precursores, el diaminopimelato (Chen, N. et al.,

J. Biol. Chem. 1993, 268 (13) :9448-66) .

Acorde con la diversa sensibilidad a la autorregulación negativa de la DDPS por la L-lisina, se observa una homología limitada en la secuencia proteica de la DDPS y en su gen correspondiente, el dapA, entre las cepas bacterianas de géneros distintos. La DDPS en B. subtilis presenta una secuencia de aminoácidos aproximadamente del 43 % y el 40 % idéntica a la de E. coli y Cor y nebacteriumGlutamicum ("C. glutamicum") , respectivamente (Chen,

N. et al., J. Biol. Chem. 1993, 268 (13) :9448-66) . Incluso en el mismo género de bacterias, las distintas cepas bacterianas presentan una homología únicamente moderada. Por ejemplo, el gen dapA de Bacillusmethanolicus ("B. methanolicus") presenta una secuencia de nucleótidos o de aminoácidos aproximadamente un 65 % idéntica a un gen dapA conocido previamente de B. subtilis (patente US n. 6.878.533) .

Un modo de mejorar la producción de L-lisina por parte de una bacteria Escherichia es superar la autorregulación negativa de la DDPS por la L-lisina. Se han realizado mutaciones en el gen dapA natural de una bacteria Escherichia para desensibilizar la DDPS a la L-lisina (patente US n. 6.040.160) . Se ha intentado asimismo introducir un gen dapA natural de una bacteria que no fuera Escherichia, en la que la DDPS correspondiente no experimentara autorregulación negativa por la L-lisina, en una bacteria Escherichia, pero no se ha conseguido obtener unos resultados coherentes y satisfactorios.

Un grupo coreano indicó que una introducción de un gen dapA natural de una cepa de C. glutamicum con hiperproducción de lisina en una cepa mutante de E. coli (TF1) que producía lisina permitió un aumento paralelo de la actividad de la DDPS sensible a la lisina y de la producción de lisina (Oh, J. et al., Biotech. Ltrs. 1991, 13 (10) :72732; patente coreana n. 10-1992-0008382) . Sin embargo, la expresión del mismo gen dapA natural en otras dos cepas de E. coli (TF13 y TF23) no dio como resultado un alto rendimiento en la producción de lisina. Como justificación de la incoherencia de los resultados se mencionó que el mecanismo de regulación implicado en la biosíntesis de la lisina es más complejo en E. coli que en las bacterias de Cor y neform.

La expresión de un gen dapA exógeno constituye un reto puesto que la xenoproteínaDDPS correspondiente se ve probablemente sometida a la descomposición por la proteasa y la formación de un cuerpo de inclusión insoluble en una bacteria Escherichia (patente US n. 6.040.160 ) . Además, no se espera que una DDPS de C. glutamicum (Oh, J. et al., Biotech. Ltrs., 1991, 13 (10) :727-32; patente coreana n. 10-1992-0008382 ) o de B. methanolicus (patente US

n. 6.878.533 ) presente su actividad ventajosa, es decir, una actividad de la DDPS insensible a la lisina que produzca un alto rendimiento de la producción de lisina, en E. coli en parte debido a que la temperatura de cultivo óptima para C. glutamicum o B. methanolicus difiere de la de E. coli en aproximadamente diez o más grados.

Se observó una regulación extremadamente complicada de la síntesis de lisina en células de E. coli, en la que se expresaban los genes implicados en la biosíntesis de la lisina en B. subtilis (Shevchenko, T.N. et al., TsitolGenet. 1984, 18 (1) :58-60) . En particular, la expresión de dichos genes exógenos, entre ellos un gen dapA exógeno, en células de E. coli no consiguió aumentar la producción de lisina a un nivel elevado y satisfactorio. Se indicó que se

puede alcanzar un aumento considerable en la biosíntesis de lisina utilizando una cepa de E. coli o B. subtilis que presente mutaciones en sus genes naturales implicados en la biosíntesis de la lisina para desensibilizar la autorregulación negativa por la lisina y el diaminopimelato.

En la actualidad, no existe procedimiento eficaz alguno para producir L-lisina utilizando una bacteria Escherichia que comprenda un gen dapA natural o variante de B. subtilis. Puesto que la demanda de L-lisina, en particular para el pienso, aumenta continuamente junto con la expansión de la población mundial, existe la necesidad de desarrollar procedimientos nuevos y eficaces para mejorar la producción de la L-lisina utilizando una cepa bacteriana de Escherichia.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Según la presente invención, una introducción de un gen dapA salvaje natural o variante de B. subtilis en una bacteria Escherichia mejora la producción de L-lisina por parte de la bacteria Escherichia a niveles industriales. Además, se puede utilizar la bacteria Escherichia transformada para producir L-lisina en un medio de cultivo con un alto rendimiento (por ejemplo, por lo menos 25, 50, 75, 100, 125 o 150 gramos por litro) .

La presente invención proporciona un ADN recombinante replicable de un modo autónomo en una bacteria Escherichia y que comprende un gen dapA natural o variante de B. subtilis. Un gen dapA variante de B. subtilis presenta una secuencia no idéntica pero sustancialmente idéntica (por ejemplo, en un 90 % 95 % o 99 %) a la secuencia de un gen dapA natural de B. subtilis. Se puede utilizar ADN recombinante para introducir un gen dapA de B. subtilis en una bacteria Escherichia para aumentar la producción de L-lisina.

El gen dapA de B. subtilis puede presentar una secuencia de ácido nucleico idéntica o sustancialmente idéntica (por ejemplo, en un 90 %, 95 % o 99 %) a la de un gen dapA de B. subtilis tal como se establece en GenBank, número de registro, L08471 (SEC ID nº : 1) y Chen, N. et al., J. Biol. Chem. 1993, 268 (13) :9448-66) . Un gen dapA variante de B. subtilis puede comprender una o más modificaciones en los nucleótidos de la SEC ID nº : 1. En una forma de realización específica no limitativa, un gen dapA variante... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. ADN recombinante replicable de un modo autónomo en una bacteria Escherichia coli, en el que el ADN recombinante comprende un gen dapA de B. subtilis y en el que el gen dapA presenta una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos por lo menos idéntica en un 90 % a la SEC ID nº : 2, y en el que se sustituye el aminoácido histidina de la posición 119 con tirosina, presentando dicha proteína actividad de dihidrodipicolinatosintasa (DDPS) .

2. ADN recombinante según la reivindicación 1, en el que el gen dapA presenta una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos de SEC ID nº : 2, y en el que se sustituye el aminoácido histidina de la posición 119 con tirosina.

3. Bacteria Escherichia coli que puede producir L-lisina y que comprende un gen dapA de B. subtilis, en el que el gen dapA presenta una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos por lo menos idéntica en un 90 % a la SEC ID nº : 2, y en el que se sustituye el aminoácido histidina de la posición 119 con tirosina, presentando dicha proteína actividad de dihidrodipicolinatosintasa (DDPS) .

4. Bacteria según la reivindicación 3, en el que el gen dapA presenta una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos de SEC ID nº : 2, y en el que se sustituye el aminoácido histidina de 20 la posición 119 con tirosina.

5. Bacteria que presenta el número de registro CGMCC nº 2923 depositada en el Centro General de Recogida de Cultivos Microbiológicos de China.

6. Bacteria que presenta el número de registro CGMCC nº 2924 depositada en el Centro General de Recogida de Cultivos Microbiológicos de China.

7. Bacteria según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en la que la bacteria produce por lo menos 50 gramos por litro de L-lisina en un medio de cultivo. 30

8. Procedimiento para producir L-lisina que comprende hacer proliferar la bacteria Escherichia coli que comprende un gen dapA de B. subtilis en un medio de cultivo y en el que el gen dapA presenta una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos por lo menos idéntica en un 90 % a la SEC ID nº : 2, y en el que se sustituye el aminoácido histidina de la posición 119 con tirosina, presentando dicha proteína actividad de dihidrodipicolinatosintasa (DDPS) , y extraer L-lisina del medio de cultivo.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que el gen dapA presenta una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos de SEC ID nº : 2, y en el que se sustituye el aminoácido histidina de la posición 119 con tirosina.