Inventos patentados en España.

Inventos patentados en España.

Inventos patentados en España en los últimos 80 años. Clasificación Internacional de Patentes CIP 2013.

METODO PARA LA PRODUCCION DE GLICEROL POR ORGANISMOS RECOMBINANTES.

Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen:

LA PRESENTE PETICION SE REFIERE A UNOS ORGANISMOS RECOMBINADOS QUE TIENEN GENES QUE CODIFICAN PARA UNA ACTIVIDAD DE GLICEROL 3 - FOSFATO DESHIDROGENASA Y/O GLICEROL - 3 - FOSFATASA

. DICHOS ORGANISMOS SON UTILES PARA LA OBTENCION DE GLICEROL A PARTIR DE VARIOS SUBSTRATOS CARBONADOS.

Solicitante: E.I. DU PONT DE NEMOURS AND COMPANY
GENENCOR INTERNATIONAL, INC.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 1007 MARKET STREET,WILMINGTON DELAWARE 19898.

Inventor/es: BULTHUIS, BEN, A., HAYNIE, SHARON, LORETTA, GATENBY,ANTHONY,ARTHUR, HSU,AMY,KUANG-HUA, LAREAU,RICHARD,D.

Fecha de Publicación de la Concesión: 23 de Septiembre de 2010.

Fecha Concesión Europea: 23 de Junio de 2010.

Clasificación Internacional de Patentes: C12P7/20 (....Glicerol [3]).

Clasificación PCT: C12N15/53 (....Oxidorreductasas (1) [5]), C12N15/55 (....Hidrolasas (3) [5]), C12N9/16 (..actúan sobre los enlaces éster (3.1) [3]), C12N1/19 (...modificados por la introducción de material genético extraño [5]), C12N1/21 (..modificados por la introducción de material genético extraño [5]), C12N9/04 (..actúan sobre grupos CHOH como dadores, p. ej. glucosa oxidasa de glucosa, deshidrogenasa láctica (1.1) [3]), C12N1/15 (..modificados por la introducción de material genético extraño [5]), C12P7/20 (....Glicerol [3]).

Clasificación antigua: C12N15/53 (....Oxidorreductasas (1) [5]), C12N15/55 (....Hidrolasas (3) [5]), C12N9/16 (..actúan sobre los enlaces éster (3.1) [3]), C12N1/19 (...modificados por la introducción de material genético extraño [5]), C12N1/21 (..modificados por la introducción de material genético extraño [5]), C12N9/04 (..actúan sobre grupos CHOH como dadores, p. ej. glucosa oxidasa de glucosa, deshidrogenasa láctica (1.1) [3]), C12N1/15 (..modificados por la introducción de material genético extraño [5]), C12P7/20 (....Glicerol [3]).

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Descripción:

Método para la producción de glicerol por organismos recombinantes.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la biología molecular y al uso de organismos recombinantes para la producción de compuestos deseados. Más específicamente, describe la expresión de genes clonados para glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (G3PDH) y glicerol-3-fosfatasa (G3P fosfatasa) para la producción reforzada de glicerol.

Antecedentes

El glicerol es un compuesto muy demandado por la industria para uso en cosméticos, jabones líquidos, alimentos, productos farmacéuticos, lubricantes, soluciones anti-congelantes, y en numerosas otras aplicaciones. Los ésteres de glicerol son importantes en la industria de las grasas y del aceite.

No todos los organismos tienen una capacidad natural de sintetizar glicerol. Sin embargo, la producción biológica de glicerol es conocida para algunas especies de bacterias, algas y levaduras. Las bacterias Bacillus licheniformis y Lactobacillus lycopersica sintetizan glicerol. La producción de glicerol se encuentra en las algas halotolerantes Dunaliella sp. y Asteromonas gracilis para la protección frente a concentraciones salinas externas elevadas (Ben-Amotz et al., (1982) Experientia 38:49-52). De manera similar, diversas levaduras osmotolerantes sintetizan glicerol como medida protectora. La mayoría de las cepas de Saccharomyces producen cierta cantidad de glicerol durante la fermentación alcohólica, y esto se puede incrementar fisiológicamente mediante la aplicación de estrés osmótico (Albertyn et al., (1994) Mol. Cell.Biol. 14, 4135-4144). En los primeros años de este siglo, el glicerol se produjo comercialmente con cultivos de Saccharomyces a los cuales se añadieron reactivos de dirección, tales como sulfitos o álcalis. Por medio de la formación de un complejo inactivo, los agentes de dirección bloquean o inhiben la conversión de acetaldehído a etanol; así, los equivalentes reductores (NADH) en exceso están disponibles o "se dirigen" hacia el dihidroxiacetona fosfato (DHAP) para la reducción para producir glicerol. Este método está limitado por la inhibición parcial del crecimiento de las levaduras debido a los sulfitos. Esta limitación se puede superar parcialmente mediante el uso de álcalis que crean equivalentes de NADH en exceso mediante un mecanismo diferente. En esta práctica, los álcalis inician una desproporción de Cannizzaro para producir etanol y ácido acético a partir de dos equivalentes de acetaldehído.

El gen que codifica glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (DAR1,GPD1) ha sido clonado y secuenciado a partir de Saccharomyces diastaticus (Wang et al., (1994), J. Bact. 176:7091-7095). El gen DAR1 se clonó en un vector lanzadera y se usó para transformar E. coli, en donde la expresión produjo la enzima activa. Wang et al., anteriormente mencionado, reconoce que DAR1 está regulado por el medio osmótico celular, pero no propone cómo se podría usar el gen para incrementar la producción de glicerol en un organismo recombinante.

Se han aislado otras enzimas de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa. Por ejemplo, sn-glicerol-3-fosfato deshidrogenasa ha sido clonada y secuenciada a partir de S. cerevisiae (Larason et al., (1993) Mol. Microbiol., 10:1101, (1993)). Albertyn et al., (1994) Mol. Cell. Biol. 14: 4135) enseñan la clonación de GPD1 que codifica una glicerol-3-fosfato deshidrogenasa de S. cerevisiae. Al igual que Wang et al., tanto Albertyn et al. como Larason et al. reconocen la osmo-sensibilidad de la regulación de este gen, pero no sugieren cómo se podría usar el gen en la producción de glicerol en un organismo recombinante.

Como con G3DPH, la glicerol-3-fosfatasa se ha aislado a partir de Saccharomyces cerevisiae, y se ha identificado que la proteína está codificada por los genes GPP1 y GPP2 (Norbeck et al., (1996) J. Biol. Chem. 271:13875). Al igual que los genes que codifican G3DPH, parece que GPP2 está osmóticamente inducido.

No existe técnica conocida que enseñe que la producción de glicerol a partir de organismos recombinantes con G3PDH/G3P fosfatasa se exprese junto o por separado. Tampoco existe técnica conocida que enseñe que la producción de glicerol a partir de cualquier organismo de tipo salvaje con estas dos actividades de enzima no requiere aplicar un cierto estrés (una sal o un osmolito) a la célula. Eustace ((1987), Can. J. Microbiol., 33:112-117)) enseñan conseguir la producción de glicerol mediante técnicas de ADN recombinante. Por técnicas de cultivo selectivas, estos investigadores crearon una cepa de levadura hibridada que producía glicerol a niveles más altos que las cepas parentales; sin embargo, la actividad de G3PDH permanecía constante o era ligeramente más baja.

Nevoight et al. (Yeast 12:1331-1337, 1996) describe que la sobre-expresión de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa en Saccharomyces cerevisiae se puede combinar con un nivel incrementado de fosfatasas para la producción de glicerol.

Un microorganismo capaz de producir glicerol en condiciones fisiológicas es industrialmente deseable, en especial cuando el propio glicerol será utilizado como un sustrato in vivo como parte de una vía catabólica o biosintética más compleja que podría ser perturbada por el estrés osmótico o la adición de agentes de dirección.

Por lo tanto, el problema a resolver es cómo dirigir el flujo de carbono hacia la producción de glicerol mediante la adición o el refuerzo de determinadas actividades enzimáticas, en especial G3PDH y G3P fosfatasa que catalizan, respectivamente, la conversión de dihidroxiacetona fosfato (DHAP) en glicerol-3-fosfato (G3P) y luego en glicerol. Este procedimiento no ha sido descrito previamente para un organismo recombinante y requería el aislamiento de genes que codifiquen las dos enzimas y su expresión subsiguiente. Una dificultad sorprendente y no anticipada con la que se topó era la toxicidad de G3P fosfatasa al hospedante que requería un control cuidadoso de sus niveles de expresión para evitar la inhibición del crecimiento.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un método para la producción de glicerol a partir de un organismo recombinante, que comprende:

(i) transformar una célula de E.coli con una casete de expresión, que comprende:

(a) un gen que codifica una enzima glicerol-3-fosfato deshidrogenasa NADH-dependiente o una enzima glicerol-3-fosfato deshidrogenasa NADH-dependiente; y

(b) un gen que codifica una enzima glicerol-3-fosfato fosfatasa;

(ii) cultivar la célula de E.coli de (i) en presencia de al menos una fuente de carbono seleccionada del grupo que consiste en monosacáridos, oligosacáridos, polisacáridos y sustratos de un solo carbono, con lo que se produce glicerol; y

(iii) recuperar el glicerol. La glucosa es la fuente de carbono más preferida.

La invención proporciona, además, células hospedantes de E. coli transformadas, que comprenden:

(a) un gen que codifica una enzima glicerol-3-fosfato deshidrogenasa NADH-dependiente o una enzima glicerol-3-fosfato deshidrogenasa NADH-dependiente; y

(b) un gen que codifica una enzima glicerol-3-fosfato fosfatasa.

Breve descripción de depósitos biológicos y listado de secuencias

La solicitante hizo los siguientes depósitos biológicos bajo los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Fines del Proceso de Patentes:


"ATCC" se refiere al depositario internacional American Type Culture Collection situado en 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 EE.UU. La denominación se refiere al número de registro del material depositado.

La solicitante ha proporcionado 23 secuencias en conformidad con las Normas para la Representación Estándar de Secuencias de Nucleótidos y Aminoácidos en Solicitudes de Patente (Anexos I y II a la Decisión del Presidente de la EPO, publicados en el Suplemento nº 2 a OJ EPO, 12/1992) y con 37 C.F.R. 1.821-1.825 y Apéndices A y B (Requisitos para Descripciones de Solicitud que Contienen Secuencias de Nucleótidos y/o Aminoácidos).

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona un método para la producción biológica de glicerol a partir de una fuente de carbono fermentable en un organismo recombinante. El método proporciona una fuente de glicerol rápida, económica y mediambientalmente responsable en las industrias cosmética y farmacéutica. El método utiliza un microorganismo que contiene genes homólogos o heterólogos clonados que codifican glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (G3PDH) y glicerol-3-fosfatasa (G3P fosfatasa). El microorganismo se pone en contacto con una fuente de carbono y el glicerol se aísla a partir de los medios acondicionados. Los genes se pueden incorporar en el microorganismo hospedante, por separado o juntos, para la producción de glicerol.

Tal como se utiliza en la presente memoria las siguientes expresiones pueden utilizarse para la interpretación de las reivindicaciones y de la memoria.

Las expresiones "glicerol-3-fosfato deshidrogenasa" y "G3PDH" se refieren a un polipéptido responsable de una actividad enzimática que cataliza la conversión de dihidroxiacetona fosfato (DHAP) en glicerol-3-fosfato (G3P). G3PDH in vivo puede ser NADH; NADPH; o FAD-dependiente. La enzima NADH-dependiente (EC 1.1.1.8) está codificada por varios genes que incluyen GPD1 (GenBank Z74071x2) o GPD2 (GenBank Z35169x1) o GPD3 (GenBank G984182) o DART1 (GenBank Z74071 x2).La enzima NADPH-dependiente (EC 1.1.1.94) está codificada por gpsA (GenBank U321643, (cds 197911-196892) G466746 y L45246). La enzima FAD-dependiente (EC 1.1.99.5) está codificada por GUT2 (GenBank Z47047x23) o glpD (GenBank G147838) o glpABC (GenBank M20938).

Las expresiones "glicerol-3-fosfatasa", "sn-glicerol-3-fosfatasa" o "d,l-glicerol fosfatasa" y "G3P fosfatasa" se refieren a un polipéptido responsable de una actividad enzimática que cataliza la conversión de glicerol-3-fosfato en glicerol. G3P fosfatasa es codificada por GPP1 (GenBank Z47047x125) o GPP2 (GenBank U18813x11).

La expresión "glicerol quinasa" se refiere a un polipéptido responsable de una actividad enzimática que cataliza la conversión de glicerol en glicerol-3-fosfato o glicerol-3-fosfato en glicerol, dependiendo de las condiciones de reacción. Glicerol-quinasa es codificada por GUT1 (GenBank U11583x19).

Los términos "GPD1", "DAR1", "OSG1", "D2830" y "YDL022W" se usarán de manera intercambiable, y se refieren a un gen que codifica una glicerol-3-fosfato deshidrogenasa citosólica, y se caracteriza por la secuencia de bases proporcionada como SEQ ID NO:1.

El término "GPD2" se refiere a un gen que codifica una glicerol-3-fosfato deshidrogenasa citosólica, y se caracteriza por la secuencia de bases proporcionada en SEQ ID NO:2.

Los términos "GUT2" y "YIL155C" se usan de manera indistinta, y se refieren a un gen que codifica una glicerol-3-fosfato deshidrogenasa mitocondrial, y se caracteriza por la secuencia de bases proporcionada en SEQ ID NO:3.

Los términos "GPP1", "RHR2" y "YIL053W" se usan de manera indistinta, y se refieren a un gen que codifica una glicerol-3-fosfatasa citosólica, y se caracteriza por la secuencia de bases proporcionada en SEQ ID NO:4.

Los términos "GPP2". "HOR2" y "YER062C" se usan de manera indistinta, y se refieren a un gen que codifica una glicerol-3-fosfatasa citosólica, y se caracteriza por la secuencia de bases proporcionada en SEQ ID NO:5.

La expresión "GUT1" se refiere a un gen que codifica una glicerol quinasa citosólica, y se caracteriza por la secuencia de bases proporcionada en SEQ ID NO:6.

Tal como se utiliza en esta memoria, las expresiones "función" y "función enzimática" se refieren a la actividad catalítica de una enzima para alterar la energía necesaria para llevar a cabo una reacción química específica. Se entiende que tal actividad puede ser aplicable a una reacción en equilibrio, en la que la producción tanto de producto como de sustrato se puede llevar a cabo en condiciones adecuadas.

Los términos "polipéptido" y "proteína" se usan de manera indistinta en esta memoria.

Las expresiones "sustrato de carbono" y "fuente de carbono" se refieren a una fuente de carbono capaz de ser metabolizada por organismos hospedadores de la presente invención, y en particular significan fuentes de carbono seleccionadas del grupo que consiste en monosacáridos, oligosacáridos, polisacáridos, y sustratos de un carbono o mezclas de los mismos.

Las expresiones "célula hospedadora" y "organismo hospedador" se refieren a un microorganismo capaz de recibir genes exógenos o heterólogos y de expresar esos genes para preparar un producto génico activo.

Las expresiones "gen exógeno", "ADN exógeno", "gen heterólogo" y "ADN heterólogo" se refieren todas a material genético nativo para un organismo que se ha colocado en un organismo hospedador diferente.

Las expresiones "organismo recombinante" y "hospedador transformado" se refieren a cualquier organismo transformado con genes heterólogos o exógenos. Los organismos recombinantes de la presente invención expresan genes exógenos que codifican G3PDH y G3P-fosfatasa para la producción de glicerol a partir de sustratos de carbono adecuados.

"Gen" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa una proteína específica, que incluye secuencias reguladoras anteriores (no codificantes en 5') y posteriores a la zona de codificación (no codificantes en 3'). Las expresiones gen "nativo" y "de tipo salvaje" se refieren al gen tal como se halla en la naturaleza con sus propias secuencias reguladoras.

Tal como se utiliza en esta memoria, las expresiones "que codifica" y "codificante" se refieren al proceso mediante el cual un gen, por medio de los mecanismos de transcripción y traducción, produce una secuencia de aminoácidos. El proceso de codificar una secuencia de aminoácidos específica pretende incluir secuencias de ADN que pueden implicar cambios de bases que no provocan un cambio en el aminoácido codificado, o que implican cambios de bases que pueden alterar uno o más aminoácidos, pero que no afectan a las propiedades funcionales de la proteína codificada por la secuencia de ADN. Por lo tanto, la invención abarca más de las secuencias específicas dadas a modo de ejemplo. También se contemplan modificaciones en la secuencia, tales como deleciones, inserciones o sustituciones en la secuencia que producen cambios imperceptibles que no afectan sustancialmente a las propiedades funcionales de la molécula proteica resultante también están incluidas. Por ejemplo, se contemplan alteraciones en la secuencia génica que reflejan la degeneración del código genético, o que dan lugar a la producción de un aminoácido químicamente equivalente en un lugar dado; así, un codón para el aminoácido alanina, un aminoácido hidrófobo, puede ser sustituido por un codón que codifique otro resto menos hidrófobo tal como glicina, o un resto más hidrófobo, tal como valina, leucina o isoleucina. Asimismo, también es de esperar que los cambios que dan lugar a la sustitución de un resto con carga negativa por otro, tales como ácido aspártico por ácido glutámico, o un resto con carga positiva por otro, tales como lisina por arginina, produzcan un producto biológicamente equivalente. Tampoco es de esperar que los cambios de nucleótidos que causan la alteración de las porciones N-terminal y C-terminal de la molécula proteica modifiquen la actividad de la proteína. En algunos casos, puede, de hecho, ser deseable preparar mutantes de la secuencia con el fin de estudiar el efecto de la alteración sobre la actividad biológica de la proteína. Cada una de las modificaciones propuestas es correcta dentro de la pericia rutinaria en la técnica, como es la determinación de la retención de la actividad biológica en los productos codificados. Además, el técnico experto reconoce que las secuencias incluidas en esta invención se definen también por su capacidad de hibridar, bajo condiciones rigurosas (SSC 0,1X, SDS al 0,1%, 65ºC), con las secuencias ejemplificadas en esta memoria.

El término "expresión" se refiere a la transcripción y traducción al producto génico a partir de un gen que codifica la secuencia del producto génico.

Los términos "plásmido", "vector" y "casete", tal como se utilizan en esta memoria, se refieren a un elemento cromosómico extra que a menudo porta genes que no son parte del metabolismo principal de la célula, y están normalmente en forma de moléculas de ADN bicatenarias circulares. Tales elementos pueden ser secuencias que se replican de manera autónoma, secuencias de integración en el genoma, secuencias de fagos o nucleotídicas, lineales o circulares, de un ADN o ARN monocatenario o bicatenario, procedentes de cualquier fuente, en las que se han unido o recombinado varias secuencias nucleotídicas en una única construcción que es capaz de introducir un fragmento promotor y una secuencia de ADN para un producto génico seleccionado junto con una secuencia sin traducir en 3' apropiada en una célula. "Casete de transformación" se refiere a un vector específico que contiene un gen exógeno y que tiene elementos además del gen exógeno, que facilitan la transformación de una célula hospedadora particular. "Casete de expresión" se refiere a un vector específico que contiene un gen exógeno y que tiene elementos además del gen exógeno que permiten la expresión incrementada de ese gen en un hospedador exógeno.

Los términos "transformación" y "transfección" se refieren a la obtención de nuevos genes en una célula tras la incorporación de ácido nucleico. Los genes obtenidos pueden estar integrados en el ADN cromosómico o introducirse como secuencias replicantes extracromosómicas. El término "transformante" se refiere a la célula que resulta de una transformación.

La expresión "modificado genéticamente" se refiere al proceso de cambio del material hereditario por transformación o mutación.

Ruta enzimática representativa

Se contempla que el glicerol se puede producir en organismos recombinantes mediante la manipulación de la ruta biosintética del glicerol que se encuentra en la mayoría de los microorganismos. Típicamente, un sustrato de carbono, tal como glucosa, se convierte en glucosa-6-fosfato a través de hexoquinasa en presencia de ATP. La glucosa-fosfato isomerasa cataliza la conversión de glucosa-6-fosfato en fructosa-6-fosfato y luego en fructosa-1,6-difosfato a través de la acción de 6-fosfofructoquinasa. El difosfato se recoge luego en dihidroxiacetona fosfato (DHAP) a través de la aldolasa. Finalmente, G3PDH NADH-dependiente convierte DHAP en glicerol-3-fosfato que después de desfosforila para dar glicerol mediante G3P fosfatasa. (Agarwal (1990), Adv. Biochem. Engrg. 41:114).

Rutas alternativas para la producción de glicerol

Se ha sugerido una ruta alternativa para la producción de glicerol a partir de DHAP (Wang et al., (1994) J. Bact. 176:7091-7095). En esta ruta propuesta, DHAP podría ser desfosforilado por una fosfatasa específica o no específica para dar dihidroxiacetona, la cual se podría luego reducir en glicerol mediante una dihidroxiacetona reductasa. La dihidroxiacetona reductasa es conocida en los procariotas y en Schizosaccharomyces pombe, y la clonación y expresión de actividades de este tipo, junto con una fosfatasa apropiada podría conducir a la producción de glicerol. Se ha sugerido otra ruta alternativa para la producción de glicerol a partir de DHAP (Redkar (1995), Experimental Mycology, 19:241, 1995). En esta ruta, DHAP se isomeriza para dar gliceraldehído-3-fosfato mediante la enzima glucolítica común triosa fosfato isomerasa. La gliceraldehído-3-fosfato se desfosforila para dar gliceraldehído, que luego se reduce mediante actividad de alcohol deshidrogenasa o glicerol deshidrogenasa NADP-dependiente. La clonación y expresión de las actividades de fosfatasa y deshidrogenasa a partir de Aspergillus nidulans podrían conducir a la producción de glicerol.

Genes que codifican G3PDH y G3P fosfatasa

La presente invención proporciona genes adecuados para la expresión de las actividades de G3PDH y G3P fosfatasa en una célula hospedadora.

Se conocen los genes que codifican G3PDH. Por ejemplo, se ha aislado GPD1 de Saccharomyces, y tiene la secuencia de bases proporcionada en SEQ ID NO:1, que codifica la secuencia de aminoácidos proporcionada en SEQ ID NO:7 (Wang et al., anteriormente mencionado). De manera similar, también se ha aislado la actividad de G3PDH de Saccharomyces codificada por GPD2 que tiene la secuencia de bases proporcionada en SEQ ID NO:2, que codifica la secuencia de aminoácidos proporcionada en SEQ ID NO:8 (Eriksson et al., (1995) Mol. Microbiol., 17:95).

Para los fines de la presente invención se contempla que sea adecuado cualquier gen que codifique un polipéptido responsable de la actividad de G3PDH, en el que esa actividad es capaz de catalizar la conversión de dihidroxiacetona fosfato (DHAP) a glicerol-3-fosfato (G3P). Además, se considera que cualquier gen que codifique la secuencia de aminoácidos de G3PDH, tal como se proporciona mediante cualquiera de SEQ ID NOS:7, 8, 9, 10, 11 y 12, que corresponden a los genes GPD1, GPD2, GUT2, gpsA, glpD, y la subunidad a de glpABC, respectivamente, será funcional en la presente invención, en la que esa secuencia de aminoácidos puede abarcar las sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos que no alteran la función de la enzima. Los expertos apreciarán que los genes que codifican G3PDH aislados de otras fuentes también serán adecuados para el uso en la presente invención. Por ejemplo, los genes aislados de procariotas incluyen los registros de GenBank M34393, M20938, L06231, U12567, L45246, L45323, L45324, L45325, U32164, U32689 y U39682. Los genes aislados de hongos incluyen los registros de GenBank U30625, U30876 y X56162; los genes aislados de insectos incluyen los registros de GenBank X61223 y X14179; y los genes aislados de fuentes de origen mamífero incluyen los registros de GenBank U12424, M25558 y X78593.

Se conocen los genes que codifican la G3P fosfatasa. Por ejemplo, se ha aislado GPP2 a partir de Saccharomyces cerevisiae y tiene la secuencia de bases dada por SEQ ID NO:5, que codifica la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO:13 (Norbeck et al., (1996), J. Biol. Chem., 271:13875).

Para los fines de la presente invención, cualquier gen que codifique una actividad de G3P fosfatasa es adecuado para uso en el método, en el que esa actividad es capaz de catalizar la conversión de glicerol-3-fosfato en glicerol. Además, cualquier gen que codifique la secuencia de aminoácidos de G3P fosfatasa proporcionada en SEQ ID NOS:13 y 14, correspondiente a los genes GPP2 y GPP1, respectivamente, será funcional en la presente invención, incluida cualquier secuencia de aminoácidos que abarque sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos que no alteran la función de la enzima G3P fosfatasa. Los expertos apreciarán que los genes que codifican G3P fosfatasa aislados de otras fuentes también serán adecuados para el uso en la presente invención. Por ejemplo, la desfosforilación de glicerol-3-fosfato para proporcionar glicerol se puede conseguir con una o más de las siguientes fosfatasas generales o específicas: fosfatasa alcalina (EC 3.1.3.1) [GenBank M19159, M29663, U02550 o M33965]; fosfatasa ácida (EC 3.1.3.2) [GenBank U51210, U19789, U28658 o L20566]; glicerol-3-fosfatasa (EC 3.1.3.-) [GenBankZ38060 o U18813x11]; glucosa-1-fosfatasa (EC 3.1.3.10) [GenBank M33807]; glucosa-6-fosfatasa (EC 3.1.3.9) [GenBank U00445]; fructosa-1,6-bisfosfatasa (EC 3.1.3.11) [GenBank X12545 o J03207] o fosfatidil glicerofosfato fosfatasa (EC 3.1.3.27) [GenBank M23546 y M23628].

Se conocen los genes que codifican la glicerol quinasa. Por ejemplo, se ha aislado y secuenciado GUT1, que codifica la glicerol quinasa de Saccharomyces (Pavlik et al., (1993), Curr. Genet, 24, 21), y la secuencia de bases se proporciona en SEQ ID NO:6, que codifica la secuencia de aminoácidos proporcionada en SEQ ID NO:15. El técnico experto apreciará que aunque la glicerol quinasa cataliza la degradación de glicerol en la naturaleza, la misma enzima será capaz de funcionar en la síntesis de glicerol, convirtiendo glicerol-3-fosfato en glicerol en las condiciones de energía de reacción apropiadas. Existe evidencia de la producción de glicerol por medio de una glicerol quinasa. En condiciones anaerobias o de inhibición de la respiración, Trypanosoma brucei da lugar a glicerol en presencia de Glicerol-3-P y ADP. La reacción transcurre en el compartimiento del glicosoma (Hammond, (1985), J. Biol. Chem. 260: 15646-15654).

Células hospedadoras

Células hospedadoras adecuadas para la producción recombinante de glicerol mediante la expresión de G3PDH y G3P fosfatasa son E. coli.

Vectores y casetes de expresión

La presente invención proporciona una diversidad de vectores y casetes de transformación y de expresión adecuados para la clonación, la transformación y la expresión de G3PDH y G3P fosfatasa en una célula hospedadora adecuada. Vectores adecuados serán aquellos que sean compatibles con la bacteria empleada. Vectores adecuados pueden proceder, por ejemplo, de una bacteria, un virus (tal como el bacteriófago T7 o un fago derivado de M-13), un cósmido, una levadura o una planta. Protocolos para obtener y utilizar vectores de este tipo son conocidos en la técnica (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual - volúmenes 1, 2, 3 (Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY, 1989)).

Típicamente, el vector o la casete contiene las secuencias que dirigen la transcripción y la traducción del gen apropiado, un marcador seleccionable, y las secuencias que permiten la replicación autónoma o la integración cromosómica. Vectores adecuados comprenden una región en 5' del gen que alberga los controles de la iniciación transcripcional y una región en 3' del fragmento de ADN que controla la terminación transcripcional. Lo más preferido es cuando las dos regiones control se derivan de genes homólogos a la célula hospedadora transformada. Regiones control de este tipo no necesitan derivarse de los genes nativos para las especies específicas elegidas como un hospedador de producción.

Las regiones o promotores de control de la iniciación que son útiles para controlar la expresión de los genes de G3PDH y G3P fosfatasa en la célula hospedadora deseada son numerosos y conocidos para los expertos en la técnica. Prácticamente cualquier promotor capaz de controlar estos genes es adecuado para la presente invención, lo que incluye, pero sin limitación, CYC1, HIS3, GAL1, GAL10, ADH1, PGK, PHO5, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO y TPI (útiles para la expresión en Saccharomyces); AOX1 (útil para la expresión en Pichia); y lac, trp, ?PL, ?PR, T7, tac y trc (útiles para la expresión en E. coli).

Las regiones de control de la terminación pueden proceder también de diversos genes nativos para los hospedadores preferidos. Opcionalmente, puede no ser necesario un sitio de terminación; sin embargo, es lo más preferido si está incluido.

Para la expresión eficaz de las presentes enzimas, el ADN que codifica las enzimas se une de manera operable por medio de codones de iniciación a las regiones de control de la expresión seleccionadas, de forma que la expresión da como resultado la formación del ARN mensajero apropiado.

Transformación de hospedadores adecuados y expresión de G3PDH y G3P fosfatasa para la producción de glicerol

Una vez que se construyen casetes adecuadas, se usan para transformar las células hospedadoras apropiadas. La introducción de la casete que contiene los genes que codifican G3PDH y/o G3P fosfatasa en la célula hospedadora se puede conseguir mediante procesos conocidos, tales como mediante transformación, p. ej., utilizando células permeabilizadas por calcio, electroporación o mediante transfección utilizando un virus de fago recombinante (Sambrook et al., anteriormente mencionado).

En la presente invención se utilizaron casetes AH21 y DAR1 para transformar la DH5a de E. coli tal como se describe completamente en los Métodos generales y los Ejemplos.

Medios y sustratos de carbono

El medio de fermentación en la presente invención debe contener sustratos de carbono adecuados. Sustratos adecuados pueden incluir pero no se limitan a monosacáridos tales como glucosa y fructosa, oligosacáridos tales como lactosa o sacarosa, polisacáridos tales como almidón o celulosa o sus mezclas y mezclas no purificadas a partir de materias primas renovables tales como filtrado de suero de queso, licor de maíz fermentado, melazas de remolacha azucarera y malta de cebada. Además, el sustrato de carbono puede ser también sustratos de un carbono tales como dióxido de carbono o metanol, para los cuales se ha demostrado una conversión metabólica en intermedios bioquímicos claves.

Se ha informado la producción de glicerol a partir de fuentes de un carbono (p.ej., metanol, formaldehído o formiato) en levaduras metilótrofas (Yamada et al., (1989), Agric. Biol. Chem., 53(2):541-543) y en bacterias (Hunter et al. (1985), Biochemistry, 24:4148-4155). Estos organismos pueden asimilar compuestos de un solo carbono, que varían en el estado de oxidación desde el metano hasta el formiato y producen glicerol. La ruta de la asimilación del carbono puede ser a través de monofosfato de ribulosa, a través de serina o a través de monofosfato de xilulosa (Gottschalk, Bacterial Metabolism, segunda edición, editorial Springer: Nueva York (1986)). La ruta de monofosfato de ribulosa implica la condensación de formiato con ribulosa-5-fosfato para formar un hidrato de carbono de 6 carbonos que se convierte en fructosa y finalmente el producto de tres carbonos gliceraldehído-3-fosfato. Asimismo, la ruta de serina asimila el compuesto de un carbono en la ruta glucolítica a través del metilentetrahidrofolato.

Además de sustratos con uno y dos carbonos los organismos metilótrofos son también conocidos por utilizar un cierto número de otros compuestos que contienen carbono tales como metilamina, glucosamina y una variedad de aminoácidos para actividad metabólica. Por ejemplo, las levaduras metilótrofas son conocidas por utilizar el carbono de la metilamina para formar trehalosa o glicerol (Bellion et al. (1993), Microb. Growth CI Compd., [Int. Symp.], 7ª, 415-32. Editor(es): Murrell, J. Collin; Kelly, Don P. Publisher: Intercept, Andover, Reino Unido). Asimismo, diversas especies de Candida metabolizarán la alanina o el ácido oleico (Sulter et al. (1990), Arch. Microbiol., 153(5), 485-9). Por lo tanto, la fuente de carbono utilizada en la presente invención puede abarcar una amplia diversidad de sustratos que contienen carbono, y estará limitada solamente por la elección del organismo.

Aunque todos los sustratos de carbono mencionados anteriormente y las mezclas de los mismos son adecuados en la presente invención, sustratos de carbono preferidos son monosacáridos, oligosacáridos, polisacáridos, sustratos de un carbono o mezclas de los mismos. Los más preferidos son azúcares, tales como glucosa, fructosa, sacarosa, maltosa, lactosa y los sustratos de un solo carbono, tales como metanol y dióxido de carbono. El más preferido como sustrato de carbono es glucosa.

Además de una fuente de carbono apropiada, el medio de fermentación debe contener minerales, sales, cofactores, tampones y otros componentes adecuados, conocidos por los expertos en la técnica, adecuados para el crecimiento de los cultivos y la promoción de la ruta enzimática necesaria para la producción de glicerol.

Condiciones de cultivo

Típicamente, las células se cultivan a 30ºC en medios apropiados. Medios de cultivo preferidos son medios corrientes comercialmente preparados tal como el caldo de cultivo Luria Bertani (LB), el caldo de cultivo con dextrosa Sabouraud (SD) o el caldo de cultivo con medio de levadura (YM). También pueden utilizarse otros medios de cultivo definidos o sintéticos, y el medio apropiado para el cultivo del microorganismo específico será conocido para un experto en la técnica de microbiología o la ciencia de fermentación. El uso de agentes conocidos para modular la represión del catabolito directa o indirectamente, p. ej., 2':3'-monofosfato de adenosina cíclico, puede también incorporarse en los medios de reacción. De manera similar, se pueden usar agentes que se sabe que modulan las actividades enzimáticas (p.ej., sulfitos, bisulfitos y álcalis) que conducen al incremento de la producción de glicerol junto con, o como alternativa, a las manipulaciones genéticas.

Intervalos de pH adecuados para la fermentación son entre pH 5,0 y pH 9,0, en donde se prefiere como intervalo de pH 6,0 a pH 8,0 para el estado inicial.

Las reacciones pueden realizarse en condiciones aerobias o anaerobias, donde se prefieren las condiciones anaerobias o microaerobias.

Identificación y purificación de G3PDH y G3P fosfatasa

Los niveles de expresión de las proteínas G3PDH y G3P fosfatasa se miden mediante ensayos enzimáticos. El ensayo de actividad de G3PDH se basa en las propiedades espectrales del co-sustrato, NADH, en la conversión de DHAP en G-3-P. NADH tiene una absorción UV/vis intrínseca, y su consumo se puede monitorizar de manera espectrofotométrica a 340 nm. La actividad de la G3P fosfatasa se puede medir mediante cualquier método de medida del fosfato inorgánico liberado en la reacción. El método de detección usado más habitualmente utiliza la determinación espectroscópica de un complejo de fosfomolibdato-amonio de color azul.

Identificación y recuperación de glicero

El glicerol se puede identificar y cuantificar mediante cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) y análisis de cromatografía de gases/espectroscopía de masas (GC/MS) en los extractos exentos de células. Se prefiere un método en el que los medios de fermentación se analizan en una columna analítica de intercambio iónico mediante el uso de una fase móvil de ácido sulfúrico 0,01 N de forma isocrática.

Métodos para la recuperación de glicerol a partir de los medios de fermentación son conocidos en la técnica. Por ejemplo, el glicerol se puede obtener a partir de medios celulares, sometiendo la mezcla de reacción a la siguiente secuencia de etapas: filtración; separación de agua; extracción con disolvente orgánico; y destilación fraccional (patente de EE.UU. nº 2.986.495).

Selección de transformantes mediante complementación

En ausencia de una G3PDH codificada por gpsA-funcional, las células E. coli son incapaces de sintetizar G3P, un estado que conduce a un bloque en la biosíntesis de la membrana. Células con un bloque de este tipo son auxotróficas, requiriendo que glicerol o G3P estén presentes en los medios de cultivo para la síntesis de fosfolípidos de la membrana.

Un gen gpsA de tipo salvaje heterólogo clonado es capaz de complementar la mutación cromosomal de gpsA para permitir el crecimiento en medios que carecen de glicerol o G3P (Wang, et al. (1994), J. Bact. 176:7091-7095). Basado en esta estrategia de complementación, el crecimiento de células defectuosas en gpsA sobre glucosa sólo se produciría si poseyeran un gpsA codificado por plásmidos, permitiendo una selección basada en la síntesis de G3P a partir de DHAP. Células que pierden el plásmido gpsA recombinante durante el cultivo fracasarían en sintetizar G3P y el crecimiento de la célula sería subsiguientemente inhibido. La actividad complementaria de G3PDH puede ser expresada no sólo a partir de gpsA, sino también a partir de otros genes clonados que expresen la actividad de G3PDH, tal como GPD1, GPD2, GPD3, GUT2, glpD y glpABC. Estos se pueden mantener en una cepa de E. coli defectuosa en gpsA tal como BB20 (Cronan et al. (1974), J. Bact., 118:598), paliando la necesidad de utilizar una selección de antibióticos y su coste prohibitivo en fermentaciones a gran escala.

Una estrategia relacionada se puede utilizar para la expresión y selección en mutantes osmorreguladores de S. cerevisiae (Larsson et al. (1993), Mol. Microbiol., 10:1101-1111). Estos mutantes osg 1 son incapaces de crecer a un bajo potencial de agua y muestran una capacidad disminuida de producir glicerol y una actividad reducida de G3PDH. El defecto de sensibilidad salina de osg1 se puede complementar mediante un gen G3PDH clonado y expresado. Así, la capacidad de sintetizar glicerol se puede utilizar simultáneamente como un marcador de selección para las células productoras de glicerol deseadas.

Ejemplos

Métodos generales

Procedimientos para fosforilaciones, ligaduras y transformaciones son bien conocidos en la técnica. Técnicas adecuadas para su utilización en los ejemplos siguientes pueden encontrarse en Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

Los materiales y métodos adecuados para el mantenimiento y crecimiento de cultivos bacterianos son bien conocidos en la técnica. Técnicas adecuadas para su utilización en los ejemplos siguientes pueden encontrarse en el Manual of Methods for General Bacteriology (Phillipp Gerhardt, R. G. E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg y G. Briggs Phillips, eds), American Society for Microbiology, Washington, DC. (1994) o en Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology (Thomas D. Brock, Segunda Edición (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA). Todos los reactivos y materiales utilizados para el crecimiento y mantenimiento de las células bacterianas se adquirieron en Aldrich Chemicals (Milwaukee, WI), DIFCO Laboratories (Detroit, MI), GIBCO/BRL (Gaithersburg, MD) o Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) a menos que se especifique de otra manera.

El significado de las abreviaturas es el siguiente: "h" significa hora(s), "min" significa minuto(s), "s" significa segundo(s), "d" significa día(s), "mL" significa mililitros, "L" significa litros.

Cepas de células

Se utilizaron las siguientes cepas de Escherichia coli para la transformación y expresión de G3PDH y G3P fosfatasa. Las cepas se obtuvieron de E. coli Genetic Stock Center o de Life Technologies, Gaithersburg, MD).

AA200 (garB10 fhuA22 ompF627 fadL701 relA1 pit-10 spoT1 tpi-1 phoM510 mcrB1) (Anderson et al., (1970), J. Gen. Microbiol., 62:329).

BB20 (tonA22 ?phoA8 fadL701 relA1 glpR2 glpD3 pit-10 gpsA20 spvT1 T2R) (Cronan et al., J. Bact., 118:598).

DH5a (deoR endA1 gyrA96 hsdR17 reeA1 relA1 supE44 thi-1 ?(lacZYA-argFV169) phi80lacZ?M15 F) (Woodcock et al., (1989), Nucl. Acids Res., 17:3469).

Identificación de Glicerol

La conversión de glucosa en glicerol se vigiló mediante HPLC y/o GC. Se realizaron análisis utilizando técnicas normalizadas y materiales disponibles por un experto en materia de cromatografía. Un método apropiado utilizó un sistema de HPLC Waters Maxima 820 que utiliza UV (210 nm) y detección por IR. Se inyectaron muestras en una columna Shodex SH-1011 (8 mm x 300 mm; Waters, Milford, MA) equipada con una precolumna Shodex SH-1011P (6 mm x 50 mm), controlada en temperatura a 50ºC, utilizando H2SO4 0,01 N en calidad de fase móvil a un caudal de 0,5 mL/min. Cuando se deseaba un análisis cuantitativo, las muestras se inyectaron en una columna Shodex SH-1011 (8 mm x 300 mm; Waters, Milford, MA) equipada con una precolumna Shodex SH-1011P (6 mm x 50 mm), controlada en temperatura a 50ºC, utilizando H2SO4 0,01 N en calidad de fase móvil a un caudal de 0,69 mL/min. Cuando se deseaba un análisis cuantitativo, las muestras se prepararon con una cantidad conocida de ácido trimetilacético en calidad de patrón externo. Típicamente, los tiempos de retención de glicerol (detección R1) y glucosa (detección R1) eran 17,03 min y 12,66 min, respectivamente.

El glicerol también se analizó mediante GC/MS. La cromatografía de gases con detección por espectroscopía de masas y la cuantificación de glicerol se realizó utilizando una columna DB-WAX (30 m, 0,32 mm D.I., espesor de la película de 0,25 um, J & W Scientific, Folsom, CA), en las condiciones siguientes: inyector: rendija, 1: 15; volumen de la muestra: 1 uL; perfil de temperaturas: temperatura inicial 150ºC con una pausa de 30 s, 40ºC/min a 180ºC, 20ºC/min a 240ºC, pausa durante 2,5 min. Detección: Espectrometría de masas EI (Hewlett Packard 5971, San Fernando, CA), SIM cuantitativo utilizando iones 61 m/z y 64 m/z como iones diana para el glicerol y el glicerol-d8, y el ion 43 m/z como ion cualificador para el glicerol. Glicerol-d8 se utilizó como un patrón interno.

Ensayo de glicerol-3-fosfatasa, GPP

El ensayo de la actividad enzimática se llevó a cabo incubando el extracto con un sustrato de fosfato orgánico en un tampón bis-Tris o MES y magnesio, pH 6,5. El sustrato utilizado era 1-a-glicerol fosfato, o d,l-a-glicerol fosfato. Las concentraciones finales de los reactivos en el ensayo son: tampón (bis-Tris 20 mM o MES 50 mM); MgCl2 (10 mM); y sustrato (20 mM). Si la proteína total de la muestra fue baja y no se dio una precipitación visible con un reactivo ácido, la muestra se ensayó convenientemente en la cubeta. Este método implicó incubar una muestra de enzima en una cubeta que contenía sustrato 20 mM (50 µL, 200 mM), tampón MES 50 mM, MgCl2 10 mM, pH 6,5. El volumen final del ensayo de fosfatasa fue 0,5 mL. La muestra que contenía la enzima se añadió a la mezcla de reacción; el contenido de la cubeta se mezcló y después se colocó la cubeta en un baño de agua en circulación a T = 37ºC durante 5 a 120 min, dependiendo el periodo de tiempo de si la actividad de la fosfatasa en la muestra de enzima oscilaba de 2 a 0,02 U/mL. La reacción enzimática se enfrió bruscamente mediante la adición del reactivo de molibdato ácido (0,4 mL). Después de añadir el reactivo de Fiske SubbaRow (0,1 mL) y agua destilada (1,5 mL), la disolución se mezcló y se dejó que se desarrollara. Al cabo de 10 min, para permitir un desarrollo completo del color, se leyó la absorbancia de las muestras a 660 nm utilizando un espectrofotómetro Cary 219 UV/Vis. La cantidad de fosfato inorgánico liberado se comparó con una curva patrón que se preparó mediante el uso de una disolución de reserva de fosfato inorgánico (0,65 mM) y preparando 6 patrones con concentraciones finales de fosfato inorgánico que oscilaban entre 0,026 y 0,130 µmol/mL.

Ensayo espectrofotométrico de la actividad de glicerol 3-fosfato deshidrogenasa (G3PDH)

Se utilizó el siguiente proceso, modificado como se muestra más abajo, a partir de un método publicado por Bell et al. (1975), J. Biol. Chem., 250:7153-8. Este método implicaba incubar una muestra enzimática en una cubeta que contenía NADH 0,2 mM; dihidroxiacetona fosfato (DHAP) 2,0 mM y enzima en tampón Tris 0,1 M/HCl, pH 7,5 con DTT 5 mM, en un volumen total de 1,0 mL a 30ºC. El espectrofotómetro se ajustó para vigilar los cambios en la absorbancia a una longitud de onda fija de 340 nm. El instrumento se ajustó a cero en una cubeta que solamente contenía tampón. Después de haber añadido la enzima a la cubeta, se hizo una lectura de la absorbancia. El primer sustrato, NADH (50 uL NADH 4 mM; la absorbancia debería aumentar aproximadamente 1,25 UA), se añadió para determinar el ritmo de fondo. El ritmo debería seguirse durante al menos 3 min. Luego se añadió el segundo sustrato DHAP (50 uL DHAP 40 mM), y se vigiló el cambio de la absorbancia a lo largo del tiempo durante al menos 3 min para determinar el ritmo bruto. La actividad de G3PDH se definió sustrayendo el ritmo de fondo del ritmo bruto.

Construcción del plásmido y construcción de la cepa

Clonación y expresión de la glicerol 3-fosfatasa para el incremento de una producción de glicerol en E. coli

Se obtuvo el clon lambda 6592 del cromosoma V de Saccharomyces cerevisiae (Gene Bank, nº de registro U18813x11) de la ATCC. El gen de la glicerol 3-fosfato fosfatasa (GPP2) se clonó mediante PCR a partir del clon lambda como ADN objetivo mediante el uso de cebadores sintéticos (SEQ ID NO:16 con SEQ ID NO:17), incorporando un sitio BamHI-RBS-Xbal en el extremo 5' y un sitio SmaI en el extremo 3'. El producto se subclonó en pCR-Script (Stratagene, Madison, WI) en el sitio SrfI para generar los plásmidos pAH15 que contenían la GPP2. El plásmido pAH15 contiene el gen GPP2 en la orientación inactiva para la expresión a partir del promotor lac en pCR-Script SK+. El fragmento BamHI-SmaI de pAH15 que contiene el gen GPP2 se insertó en pBlueScriptII SK+ para generar el plásmido pAH19. El pAH19 contiene el gen GPP2 en la orientación correcta para la expresión a partir del promotor lac. El fragmento XbaI-PstI de pAH19 que contiene el gen GPP2 se insertó en pPHOX2 para crear el plásmido pAH21. pAH21/ DH5a es el plásmido de expresión.

Plásmidos para la sobre-expresión de DAR1 en E. coli

DAR1 se aisló mediante clonación por PCR a partir de ADN genómico de S. cerevisiae mediante el uso de cebadores sintéticos (SEQ ID NO:18 con SEQ ID NO:19). Los sitios de clonación mediante PCR eficaces son el sitio NcoI en el extremo 5' de DAR1 en donde el ATG de NcoI es la metionina de iniciación de DAR1. En el extremo 3' de DAR1 se introduce un sitio BamHI tras el terminador de la traducción. Los fragmentos de PCR se digirieron con NcoI + BamHI y se clonaron en los mismos sitios en el plásmido de expresión pTrc99A (Pharmacia, Piscataway, NJ) para proporcionar pDAR1A.

Para crear un sitio de unión al ribosoma más adecuado en el extremo 5' de DAR1, se insertó un ligador SpeI-RBS-NcoI obtenido renaturalizando cebadores sintéticos (SEQ ID NO:20 con SEQ ID NO:21) en el sitio NcoI de pDAR1A para crear pAH40. El plásmido pAH40 contiene el nuevo RBS y el gen DAR1 en la orientación correcta para la expresión a partir del promotor trc de pTrc99A (Pharmacia, Piscataway, NJ). Se insertó el fragmento NcoI-BamHI de pDAR1A y un segundo grupo de ligadores SpeI-RBS-NcoI obtenidos renaturalizando cebadores sintéticos (SEQ ID NO:22 con SEQ ID NO:23) en el sitio SpeI-BamHI de pBC-SK+ (Stratagene, Madison, WI) para crear el plásmido pAH42. El plásmido pAH42 contiene un gen resistente a cloranfenicol.

Construcción de casetes de expresión para DAR1 y GPP2

Se construyeron casetes de expresión para DAR1 y GPP2 a partir de los subclones DAR1 y GPP2 individuales descritos anteriormente mediante el uso de métodos habituales de biología molecular. Se insertó el fragmento BamHI-PstI de pAH19 que contenía el sitio de unión ribosomal (RBS) y el gen GPP2 en pAH40 para crear pAH43. Se insertó el fragmento BamHI-PstI de pAH19 que contenía el RBS y el gen GPP2 en pAH42 para crear pAH45.

El sitio de unión al ribosoma en el extremo 5' de GPP2 se modificó como sigue. Un enlazador BamHI-RBS-SpeI, obtenido al renaturalizar cebadores sintéticos GATCCAGGAAACAGA (SEQ ID NO:24) con CTAGTCTGTTTCCTG (SEQ ID NO:25) al fragmento XbaI-PstI procedente de pAH19 que contenía el gen GPP2, se insertó en el sitio BamHI-PstI de pAH40 para crear pAH48. El plásmido pAH48 contiene el gen DAR1, el RBS modificado y el gen GPP2 en la orientación correcta para la expresión a partir del promotor trc de pTrc99A (Pharmacia, Piscataway, NJ).

Transformación de E. coli

Todos los plásmidos aquí descritos se transformaron en DH5a de E. coli utilizando técnicas de biología molecular estándares. Los transformantes se verificaron mediante su modelo RFLP de ADN.

Ejemplo 1

Producción de glicerol a partir de E. coli transformada con el gen G3PDH

Medios

Se utilizaron medios sintéticos para la producción anaerobia o aerobia de glicerol utilizando células de E. coli transformadas con pDAR1A. Los medios contenían, por litro, 6,0 g de Na2HPO4, 3,0 g de KH2PO4, 1,0 g de NH4Cl, 0,5 g de NaCl, 1 mL de MgSO4 al 20%.7H2O, 8,0 g de glucosa, 40 mg de casaminoácidos, 0,5 ml de hidrocloruro de tiamina al 1%. 100 mg de ampicilina.

Condiciones de Crecimiento

La cepa AA200 que alberga pDAR1A o el vector pTrc99A se hizo crecer en condiciones aerobias en 50 mL de medios, sacudiendo a 250 rpm en matraces de 250 mL a 37ºC. A A600 0,2-0,3 se añadió isopropiltio-ß-D-galactósido hasta una concentración final de 1 mM y la incubación continuó durante 48 h. Para el crecimiento anaerobio, se utilizaron muestras de crecimiento de células inducidas para llenar tubos Falcon nº2054 que estaban cerrados mediante tapón y se mezclaron suavemente mediante rotación a 37ºC durante 48 h. La producción de glicerol se determinó mediante análisis por HPLC de los sobrenadantes del cultivo. La cepa pDAR1A/AA200 producía 0,38 g/L de glicerol después de 48 h en condiciones anaerobias, y 0,48 g/L en condiciones aerobias.

Ejemplo 2

Producción de glicerol a partir de E. coli transformada con el gen G3P fosfatasa (GPP2)

Medios

Se utilizaron medios phoA sintéticos en matraces de sacudimiento para demostrar el incremento de glicerol mediante la expresión de GPP2 en E. coli. El medio phoA contenía por litro: Amisoy, 12 g; sulfato amónico, 0,62 g; MOPS, 10,5 g; citrato de Na, 1,2 g; NaOH (1 M), 10 mL; MgSO41 M, 12 mL; elementos traza 100X, 12 mL; glucosa al 50%, 10 mL; tiamina al 1%, 10 mL; 100 mg/mL de L-prolina, 10 mL; FeCl3 2,5 mM, 5 mL; tampón fosfatos mixtos, 2 mL (5 mL de NaH2PO4 0,2 M + 9 mL de K2HPO4 0,2 M), y pH hasta 7,0. Los elementos traza 100X para el medio phoA /L contenían: ZnSO4.7 H2O, 0,58 g; MnSO4.H2O, 0,34 g; CuSO4.5 H2O, 0,49 g; CoCl2.6 H2O, 0,47 g; H3BO3, 0,12 g, NaMoO4.2 H2O, 0,48 g.

Experimentos en matraces de sacudimiento

Las cepas pAH21/DH5a (que contenían el gen GPP2) y pPHOX21/DH5a (control) se hicieron crecer en 45 mL de medios (medios phoA, 50 ug/mL de carbenicilina y 1 ug/mL de vitamina B12) en un matraz de sacudimiento de 250 mL a 37ºC. Los cultivos se hicieron crecer en condiciones aerobias (sacudimiento a 250 rpm) durante 24 h. La producción de glicerol se determinó mediante análisis por HPLC del sobrenadante del cultivo. pAH21/DH5a producía 0,2 g/L de glicerol al cabo de 24 h.

Ejemplo 3

Producción de glicerol a partir de D-glucosa utilizando E. coli recombinante que contenía tanto GPP2 como DAR1

El crecimiento para la demostración de la producción incrementada de glicerol por parte de pAH43 que contenía DH5a de E. coli prosigue en condiciones aerobias a 37ºC en cultivos en matraces de sacudimiento (matraces Erlenmeyer, volumen de líquido 1/5 del volumen total).

Los cultivos en medios mínimos/matraces de sacudimiento con glucosa al 1% se inician mediante inoculación a partir de cultivo durante una noche LB/glucosa al 1% con selección del antibiótico. Los medios mínimos son: medios definidos esterilizados con filtro, pH final 6,8 (HCl), contenían por litro: 12,6 g de (NH4)2SO4, 13,7 g de K2HPO4, 0,2 g de extracto de levaduras (Difco), 1 g de NaHCO3, 5 mg de vitamina B12, 5 mL de Solución de Elementos Traza Modificada de Balch (cuya composición se puede encontrar en Methods for General and Molecular Bacteriology (P. Gerhardt et al., eds, pág. 158, American Society for Microbiology, Washington, DC (1994)). Los matraces de sacudimiento se incuban a 37ºC con agitación intensa durante una noche, tras lo cual se toman muestras para análisis por GC del sobrenadante. El pAH43/DH5a mostraba una producción de glicerol de 3,8 g/L al cabo de 24 h.

Ejemplo 4

Producción de glicerol a partir de D-glucosa utilizando E. coli recombinante que contenía tanto GPP2 como DAR1

El Ejemplo 4 ilustra la producción de glucosa a partir de DH5a/pAH48 recombinante de E. coli, que contenía los genes tanto GPP2 como DAR1.

La cepa DH5a/pAH48 se construyó según se describe antes en los Métodos Generales.

Pre-Cultivo

DH5a/pAH48 se pre-cultivaron para la siembra en una operación de fermentación. Componentes y protocolos para el pre-cultivo se listan más abajo.

Medios de Pre-Cultivo

Los componentes de los medios de arriba se mezclaron juntos y el pH se ajustó a 6,8 con NH4OH. Los medios se esterilizaron luego con el filtro.

Metales trazas se utilizaron de acuerdo con la receta siguiente:

Los cultivos se iniciaron a partir de cultivo de siembra, inoculado a partir de 50 µL de material congelado (glicerol al 15% en forma de crioprotector) a 600 mL de medio en un matraz Erlenmeyer de 2-L. Los cultivos se hicieron crecer a 30ºC en un sacudidor a 250 rpm durante aproximadamente 12 h y luego se utilizaron para sembrar el fermentador.

Crecimiento en fermentación

Recipiente

Fermentador con tanque agitado de 15-L.

Medio

Los componentes anteriores se esterilizaron juntos en el recipiente fermentador. El pH se elevó hasta 6,7 con NH4OH. Se añadieron extracto de levaduras (5 g/L) y solución de metales trazas (5 mL/L) en condiciones asépticas a partir de soluciones patrón esterilizadas con filtro. Se añadió glucosa a partir de una alimentación del 60% para dar una concentración final de 10 g/L. Se añadió carbenicilina a 100 mg/L. El volumen tras la inoculación era de 6 L.

Condiciones Medioambientales para la Fermentación

La temperatura se controló a 36ºC y el caudal de aire se controló a 6 litros estándar por minuto. La retropresión se controló a 0,5 bar. El agitador se ajustó a 350 rpm. Se utilizó amoniaco acuoso para el control del pH a 6,7. La velocidad de alimentación de glucosa (glucosa monohidrato al 60%) se controló para mantener la glucosa en exceso.

Resultados

Los resultados de la operación de fermentación se dan en la Tabla 1.

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1




Reivindicaciones:

1. Un método para la producción de glicerol a partir de un microorganismo recombinante, que comprende:

(i)transformar una célula de E. coli con: (a)una casete de expresión que comprende: (a-i)un gen que codifica una enzima glicerol-3-fosfato deshidrogenasa NADH-dependiente o una enzima glicerol-3-fosfato deshidrogenasa NADH-dependiente; y (a-ii) un gen que codifica una enzima glicerol-3-fosfato fosfatasa, o (b) una primera casete de expresión que comprende un gen que codifica una enzima glicerol-3-fosfato deshidrogenasa NADH-dependiente o una enzima glicerol-3-fosfato deshidrogenasa NADH-dependiente; y una segunda casete de expresión que comprende un gen que codifica una enzima glicerol-3-fosfato fosfatasa; (ii) cultivar la célula de E.coli de (i) transformada en presencia de al menos una fuente de carbono seleccionada del grupo que consiste en monosacáridos, oligosacáridos, polisacáridos y sustratos de un solo carbono, con lo que se produce glicerol; y (iii) recuperar el glicerol producido en (ii).

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la fuente de carbono es glucosa.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el gen que codifica una enzima glicerol-3-fosfato deshidrogenasa NADH-dependiente o una enzima glicerol-3-fosfato deshidrogenasa NADPH-dependiente codifica la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 o SEQ ID NO: 10.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el gen que codifica una enzima de glicerol-3-fosfato fosfatasa codifica la secuencia de aminoácidos proporcionada en SEQ ID NO 13 o SEQ ID NO:14.

5. Una célula hospedadora transformada de E.coli, que comprende:

(a) una casete de expresión que comprende: (a-i)un gen que codifica una enzima glicerol-3-fosfato deshidrogenasa NADH-dependiente o una enzima glicerol-3-fosfato deshidrogenasa NADH-dependiente; y (a-ii)un gen que codifica una enzima glicerol-3-fosfato fosfatasa; o (b) una primera casete de expresión que comprende un gen que codifica una enzima glicerol-3-fosfato deshidrogenasa NADH-dependiente o una enzima glicerol-3-fosfato deshidrogenasa NADH-dependiente; y una segunda casete de expresión que comprende un gen que codifica una enzima glicerol-3-fosfato fosfatasa.

6. Una célula hospedadora de E. coli transformada de acuerdo con la reivindicación 5, en la que el gen que codifica una enzima de glicerol-3-fosfato fosfatasa codifica la secuencia de aminoácidos proporcionada en SEQ ID NO 13 o SEQ ID NO:14.


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