Método para la detección específica del virus de la peste porcina clásica.

Un método para determinar la presencia de un virus de la peste porcina clásica (CSFV) en un sujeto,

que comprende la operación siguiente:

- detección de la región NS5A de al menos un genoma de virus de la peste porcina clásica (CSFV) en una muestra procedente de dicho sujeto; por medio de la multiplicación de ácido nucleico, en donde la multiplicación se lleva a cabo utilizando al menos un cebador para multiplicación de CSFV, en donde dicho al menos un cebador para multiplicación de CSFV comprende un extremo 3' que consiste en al menos los 6 últimos nucleótidos según la secuencia de ID. SEC. nº 3 o ID. SEC. nº 4, y

en donde la detección de la región NS5A del al menos un genoma de virus de la peste porcina clásica (CSFV) se atribuye a la presencia de un virus de la peste porcina clásica (CSFV) en dicho sujeto.

Método para la detección específica del virus de la peste porcina clásica.

Antecedentes de la invención La peste porcina clásica (CSF; del inglés, classical swine fever) es una enfermedad infecciosa muy contagiosa y a menudo fatal en cerdos domésticos y jabalíes. Los brotes en las producciones industrializadas de cerdos son controlados mediante medidas sanitarias y el sacrificio a gran escala y causan pérdidas económicas significativas [S. Edwards, A. Fukusho, P. C. Lefevre, A. Lipowski, Z. Pejsak, P. Roehe y J. Westergaard, 2000, "Classical swine fever: the global situation", Vet. Microbiol. 73 (2-3) , 103-119; C. M. Fauquet et al., 2005, "Virus Taxonomy, VIIIth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses", Elsevier / Academic Press, 2005; J. Vandeputte y

G. Chappuis, 1999, "Classical swine fever: the European experience and a guide for infected areas", Rev. Sci. Tech. 18 (3) , 638-647]. Los brotes de CSF han de ser comunicados a la OIE (Office International des Epizooties) , y la enfermedad es controlada en la Unión Europea (UE) mediante una política de supresión sin vacunación profiláctica. A pesar de los continuos esfuerzos para su erradicación, aún se producen regularmente brotes de CSF en los cerdos domésticos europeos.

El virus de la CSF (CSFV; del inglés, classical swine fever virus) es un miembro del género Pestivirus de la familia Flaviviridae y está íntimamente relacionado con el virus de la diarrea vírica bovina (BVDV; del inglés, bovine viral diarrhoea virus) y el virus de la enfermedad de la frontera (BDV; del inglés, border disease virus) (C. M. Fauquet y D. Fargette, 2005, "International Committee on Taxonomy of Viruses and the 3, 142 unassigned species", Virol J. 2, 64) . Los huéspedes naturales del BVDV y el BDV son los ganados bovino y ovino, respectivamente, aunque ambos virus también infectan naturalmente a los cerdos. Es importante diferenciar entre CSFV y BVDV o BDV.

Los pestivirus son pequeños virus de RNA de cadena sencilla y sentido positivo con un genoma de aproximadamente 12, 3 kb (G. Meyers y H. J. Thiel, 1996, "Molecular characterization of pestiviruses", Adv. Virus Res. 47, 53-118) . El genoma comprende un marco de lectura abierto que codifica una sola poliproteína de 3898 aminoácidos que está flanqueada por una región no traducida (UTR; del inglés, untranslated region) 5'-terminal y una UTR 3'-terminal. La poliproteína es cotraduccional y postraduccionalmente procesada por proteasas víricas y celulares (G. Meyers y H. J. Thiel, 1996, "Molecular characterization of pestiviruses", Adv. Virus Res. 47, 53-118) . Es escindida en cuatro proteínas estructurales (C, ERNS, E1 y E2) y siete proteínas no estructurales (Npro, p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B) [N. Tautz, K. Elbers, D. Stoll, G. Meyers y H. J. Thiel, 1997, "Serine protease of pestiviruses: determination of cleavage sites", J. Virol. 71 (7) , 5415-22].

Para un control y una prevención eficaces de la propagación del virus durante los brotes de CSF, es particularmente importante una rápida, sensible y fiable detección del CSFV. El CSFV puede ser detectado mediante protocolos de aislamiento del virus, ELISA de antígenos, RT-PCR basada en gel y RT-PCR en tiempo real [M. Agüero, J. Fernández, L. J. Romero, M. J. Zamora, C. Sánchez, S. Belák, M. Arias y J. M. Sánchez-Vizcaíno, 2004, "A highly sensitive and specific gel-based multiplex RT-PCR assay for the simultaneous and differential diagnosis of African swine fever and Classical swine fever in clinical samples", Vet. Res. 35 (5) , 551-563; G. Hergarten, K. P. Hurter y R.

G. Hess, 2001, "Detection of infection with classical swine fever virus in wild boar: a comparison of different laborator y diagnostic methods", Dtsch. Tierarztl. Wochenschr. 108 (2) , 51-54].

Se dispone de diferentes protocolos de RT-PCR en tiempo real que se usan en los laboratorios de diagnosis [D. Barlic-Maganja y J. Grom, 2001, "Highly sensitive one-tube RT-PCR and microplate hybridisation assay for the detection and for the discrimination of classical swine fever virus from other pestiviruses", J. Virol. Methods 95 (1-2) , 101-110; B. Hoffmann, M. Beer, C. Schelp, H. Schirrmeier y K. Depner, 2005, "Validation of a real-time RT-PCR assay for sensitive and specific detection of classical swine fever. J. Virol. Methods 130 (1-2) , 36-44; B. Hoffmann, K. Depner, H. Schirrmeier y M. Beer, 2006, "A universal heterologous internal control system for duplex real-time RT-PCR assays used in a detection system for pestiviruses. J. Virol. Methods 136 (1-2) , 200-209; I. Leifer, K. Depner, S. Blome, M. F. Le Potier, D. M. Le, M. Beer y B. Hoffmann, 2009a, "Differentiation of C-strain "Riems" or CP7_E2alf vaccinated animals from animals infected by classical swine fever virus field strains using real-time RT-PCR", J. Virol. Methods 158 (1-2) , 114-122; J. J. Zhao, D. Cheng, N. Li, Y. Sun, Z. Shi, Q. H. Zhu, C. Tu, G. Z. Tong y H. J. Qiu, 2008, "Evaluation of a multiplex real-time RT-PCR for quantitative and differential detection of wild-type viruses and C-strain vaccine of Classical swine fever virus", Vet. Microbiol. 126 (1-3) , 1-10]. En todos los protocolos establecidos se usa el 5'-UTR conservado como molde para la detección de cepas de campo del CSFV. Se ha descrito recientemente un protocolo específico para la cepa C en que se usa la región genómica ERNS para la detección específica del virus de vacuna de la cepa C "Riems" de CSF [I. Leifer, K. Depner, S. Blome, M. F. Le Potier, D. M. Le, M. Beer y B. Hoffmann, 2009a, "Differentiation of C-strain "Riems" or CP7_E2alf vaccinated animals from animals infected by classical swine fever virus field strains using real-time RT-PCR", J. Virol. Methods 158 (1-2) , 114-122]. En situaciones con elevada producción de material de muestra positivo, la contaminación de amplicones por la propia RT-PCR en tiempo real o por otras aplicaciones de RT-PCR que se dirigen a la misma región genómica, como el análisis de secuencias, puede interferir en el diagnóstico del CSFV. Por lo tanto, existe la necesidad de otro método

específico para la detección del CSFV. El nuevo método ha de ser compatible con la detección de genes de referencia; es decir, la detección de un gen de referencia no ha de interferir en el nuevo método de detección.

La publicación de Haegeman et al. ["Characterisation of the discrepancy between PCR and virus isolation in relation to classical swine fever virus detection", Journal of Virological Methods, volumen 136, nº 1-2, septiembre de 2006 (2006-09) , páginas 44-50] se refiere al mismo problema pero, como se esbozará más adelante y también se mostrará experimentalmente, no resuelve el problema.

Wong Min-Liang et al. ("Molecular cloning and nucleotide sequence of 3'-terminal region of classical swine fever virus LPC vaccine strain", Virus Gene, volumen 17, nº 3, 1998, páginas 213-218) describen dos ensayos por PCR para la detección de CSFV. Las dianas para una PCR diagnóstica son una región de 1887 pares de bases que encierra el gen NS5A completo, multiplicada con la pareja de cebadores P2/C4, y una región de 134 pares de bases que encierra parte de la región 3' de NS5A y la región 5' del gen NS5B, multiplicada con la pareja de cebadores P3/C5. Como se esbozará más adelante y también se mostrará experimentalmente, Wong Min-Liang et al. no resuelven el problema.

Los inventores hallaron inesperadamente que el CSFV puede ser específicamente detectado mediante la detección de la región NS5A o partes de la misma. Por consiguiente, la presente invención proporciona un nuevo método para la detección específica del CSFV. Además, los inventores fueron capaces de detectar cepas del virus de la peste porcina clásica (CSFV) de las que se desconocía la región NS5A (ID. SEC. números 37 a 41) . Esto muestra inequívocamente que el método de acuerdo con la presente invención proporciona un método mediante el cual se pueden detectar todas las cepas de CSFV, siendo muy específico para el CSFV.

Descripción de la invención La presente invención se refiere a un método para determinar la presencia de un virus de la peste porcina clásica (CSFV) en un sujeto, que comprende la operación siguiente:

– detección de la región NS5A de al menos un genoma de virus de la peste porcina clásica (CSFV) en una muestra procedente de dicho sujeto; por medio de la multiplicación de ácido nucleico, en donde la multiplicación se lleva a cabo utilizando al menos un cebador para multiplicación de CSFV, en donde dicho al menos un cebador para multiplicación de CSFV comprende un extremo 3' que consiste en al menos los 6 últimos nucleótidos según la secuencia de ID. SEC. nº 3 o ID. SEC. nº 4, y en donde la detección de la región NS5A o partes de la misma del... [Seguir leyendo]

1. Un método para determinar la presencia de un virus de la peste porcina clásica (CSFV) en un sujeto, que comprende la operación siguiente:

– detección de la región NS5A de al menos un genoma de virus de la peste porcina clásica (CSFV) en una muestra procedente de dicho sujeto; por medio de la multiplicación de ácido nucleico, en donde la multiplicación se lleva a cabo utilizando al menos un cebador para multiplicación de CSFV, en donde dicho al menos un cebador para multiplicación de CSFV comprende un extremo 3' que consiste en al menos los 6 últimos nucleótidos según la secuencia de ID. SEC. nº 3 o ID. SEC. nº 4, y

en donde la detección de la región NS5A del al menos un genoma de virus de la peste porcina clásica (CSFV) 10 se atribuye a la presencia de un virus de la peste porcina clásica (CSFV) en dicho sujeto.

2. El método según la Reivindicación 1, en donde la detección de la región NS5A comprende el uso de una sonda de ácido nucleico que se hibrida con la región NS5A de al menos un genoma de virus de la peste porcina clásica (CSFV) y/o con un ácido nucleico complementario de la al menos una región NS5A del al menos un genoma de virus de la peste porcina clásica (CSFV) .

3. El método según la Reivindicación 2, en donde la sonda de ácido nucleico se hibrida con cualquiera de las secuencias del grupo que consiste en las ID. SEC. números 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 y 41, o fragmentos de las mismas.

4. El método según la Reivindicación 2 o 3, en donde la sonda de ácido nucleico comprende al menos una modificación para aumentar la estabilidad del híbrido de sonda-diana.

5. El método según cualquiera de las Reivindicaciones 2 a 4, en donde la sonda de ácido nucleico comprende al menos 4 modificaciones para aumentar la estabilidad del híbrido de sonda-diana y en donde dichas modificaciones son ácidos nucleicos bloqueados (LNA) .

6. El método según cualquiera de las Reivindicaciones 2 a 5, en donde la sonda de ácido nucleico comprende la secuencia de ID. SEC. nº 2.

7. El método según cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 6, en donde, antes de la detección de la región NS5A del al menos un genoma de virus de la peste porcina clásica (CSFV) , se multiplica dicho genoma del al menos un virus de la peste porcina clásica (CSFV) o partes del mismo.

8. El método según la Reivindicación 7, en donde el producto de multiplicación comprende la secuencia según la ID. SEC. nº 2.

9. El método según cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 8, en donde la multiplicación y/o la detección de la región NS5A se llevan a cabo mediante RT-PCR en tiempo real.

10. Un kit para determinar la presencia de un virus de la peste porcina clásica (CSFV) en un sujeto, que comprende:

– una sonda de ácido nucleico, en donde la sonda de ácido nucleico es capaz de hibridarse con la región NS5A del genoma de al menos un virus de la peste porcina clásica (CSFV) y/o con un ácido nucleico complementario de la región NS5A del genoma de al menos un virus de la peste porcina clásica (CSFV) , en donde la sonda de ácido nucleico comprende la secuencia de ID. SEC. nº 2 y al menos un cebador para la secuenciación de la región NS5A del al menos un virus de la peste porcina clásica (CSFV) o partes de la misma.

11. El kit según la Reivindicación10, que comprende además al menos un cebador para multiplicación de CSFV para multiplicar el genoma de al menos un virus de la peste porcina clásica (CSFV) o partes del mismo, en donde la parte multiplicada del genoma de dicho al menos un virus de la peste porcina clásica (CSFV) comprende la secuencia de ID. SEC. nº 2.

12. Una sonda de ácido nucleico con una longitud de 16 a 40 nucleótidos, en donde el ácido nucleico comprende 45 la secuencia según la ID. SEC. nº 2.

13. Uso de un ácido nucleico que comprende un extremo 3' que consiste en al menos los 6 últimos nucleótidos según la secuencia de ID. SEC. nº 3 o ID. SEC. nº 4, en donde el ácido nucleico es capaz de multiplicar la región NS5A de al menos un CSFV o fragmentos de la misma, en un método según las Reivindicaciones 1 a 9.

14. Uso de un kit según la Reivindicación 10 o 11 o un ácido nucleico según la Reivindicación 12 en un método

según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.