Procedimientos y composiciones que implican miARN y moléculas inhibidoras de miARN.

Una molécula de ácido nucleico de miARN sintético que comprende una secuencia con al menos 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de miR-29 humana madura para su uso como un medicamento

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Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E10183596.

Solicitante: Asuragen, Inc.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 2150 Woodward St Suite 100 Austin TX 78744 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: BROWN, DAVID, DEVROE,ERIC, FORD,LANCE, CHENG,ANGIE, JARVIS,RICH, BYROM,MIKE, OVCHARENKO,DMITRIY, KELNAR,KEVIN.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/68 (en los que intervienen ácidos nucleicos)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/11 (Fragmentos de ADN o de ARN; sus formas modificadas (ADN o ARN no empleado en tecnología de recombinación C07H 21/00))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/113 (Acidos nucleicos no codificantes que modulan la expresión de genes, p.ej. oligonucleótidos antisentido)

PDF original: ES-2534304_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Procedimientos y composiciones que implican miARN y moléculas inhibidoras de miARN

1. Campo de la invención

La presente invención se refiere en general al campo de la biología molecular. Más particularmente, se refiere a procedimientos y composiciones que Implican moléculas de ácido nucleico que simulan mlcroARN (miARN) y que Inhiben miARN. Se describen procedimientos y composiciones que Implican miARN sintéticos y moléculas Inhibidoras de miARN. Además, también se describen procedimientos y composiciones para identificar miARN que contribuyen a procesos celulares. Además, la identificación de miARN que contribuyen a procesos celulares proporciona dianas para intervención terapéutica asi como análisis de diagnóstico y/o pronóstico.

2. Descripción de la técnica relacionada

En 2001, varios grupos usaron un nuevo procedimiento de clonación para aislar e identificar un gran grupo de "microARN" (miARN) de C. elegans, Drosophila y seres humanos (Lagos-Quintana y col., 2001; Lau y col., 2001; Lee y Ambros, 2001). Se han identificado varios cientos de miARN en plantas y animales, incluyendo seres humanos, que no parecen tener ARNip endógenos. Por lo tanto, aunque son similares a los ARNip, los miARN son no obstante distintos.

Los miARN observados hasta la fecha han sido de aproximadamente 21-22 nucleótidos de longitud y surgen de precursores más largos, que se transcriben de genes no codificantes de proteínas. Véase la revisión de Carrington y col. (2003). Los precursores forman estructuras que se pliegan entre si en regiones autocomplementarias; después se procesan por la nucleasa Dicer en animales o DCL1 en plantas. Las moléculas de miARN interrumpen la traducción mediante formación de pares de bases precisa o imprecisa con sus dianas.

Los miARN parecen estar implicados en la regulación génica. Algunos miARN, incluyendo lin-4 y let-7, inhiben la síntesis proteica uniéndose con regiones no traducidas 3 parcialmente complementarias (3 UTR) de ARNm diana. Otros, incluyendo el miARN Scarecrow hallado en plantas, actúan como ARNip y se unen con secuencias de ARNm perfectamente complementarias para destruir el transcrito diana (Grishok y col., 2001).

La investigación sobre microARN está aumentando a medida que los científicos comienzan a apreciar el papel general que estas moléculas desempeñan en la regulación de la expresión génica eucariota. Los dos miARN mejor entendidos, lin-4 y let-7, regulan la temporización del desarrollo en C. elegans regulando la traducción de una familia de ARNm clave (revisado en Pasquinelli, 2002). Se han identificado varios cientos de miARN en C. elegans, Drosophila, ratón y seres humanos. Como se esperarla para moléculas que regulan la expresión génica, se ha mostrado que los niveles de miARN varían entre tejidos y estados del desarrollo. Además, un estudio muestra una fuerte correlación entre la expresión reducida de dos miARN y la leucemia linfocítica crónica, proporcionando una posible conexión entre miARN y cáncer (Calin, 2002). Aunque el campo aún es joven, se especula que los miARN podrían ser tan importantes como los factores de transcripción en la regulación de la expresión génica en eucariotas superiores.

Hay algunos ejemplos de miARN que desempeñan papeles críticos en la diferenciación celular, desarrollo temprano y procesos celulares como apoptosis y metabolismo de grasas, lin-4 y let-7 regulan ambos el paso de un estado larvario a otro durante el desarrollo de C. elegans (Ambros, 2003). Mir-14 y bantam son miARN de Drosophila que regulan la muerte celular, aparentemente regulando la expresión de genes implicados en la apoptosis (Brennecke y col., 2003, Xu y col., 2003). El miR14 también se ha implicado en el metabolismo de grasas (Xu y col., 2003). Lsy-6 y miR-273 son miARN de C. elegans que regulan la simetría en neuronas quimiosensoriales (Chang y col., 2004). Otro miARN animal que regula la diferenciación celular es miR-181, que guía la diferenciación de células hematopoyéticas (Chen y col., 2004). Estas moléculas representan la serie completa de miARN animales con funciones conocidas. Además, Lagos-Quintana y col. Science (2001) 294:853-858 desvela el miARN m¡R-29. El entendimiento potenciado de las funciones de miARN revelará sin duda redes reguladoras que contribuyan al desarrollo normal, diferenciación, comunicación ¡nter e ¡ntracelular, ciclo celular, angiogénesis, apoptosis y muchos otros procesos celulares. Dados sus papeles importantes en muchas funciones biológicas, es probable que los miARN ofrezcan puntos importantes para intervención terapéutica o análisis de diagnóstico.

Caracterizar las funciones de biomoléculas como miARN implica con frecuencia introducir las moléculas en células o retirar las moléculas de células y medir el resultado. Si la introducción de un miARN en células da como resultado apoptosis, entonces el miARN participa sin duda en una ruta apoptótica. Se han descrito procedimientos para introducir o retirar miARN de células. Dos publicaciones recientes describen moléculas antisentido que pueden usarse para inhibir la actividad de miARN específicos (Meister y col., 2004; Hutvagner y col., 2004). Otra publicación describe el uso de plásmidos que se transcriben por ARN polimerasas endógenas y producen miARN específicos cuando se usan para transfectar células (Zeng y col., 2002). Estos dos conjuntos de reactivos se han usado para evaluar miARN individuales.

Una limitación del sistema de expresión de miARN basado en plásmidos es que las eficacias de transfección para plásmidos tienden a ser muy bajas, expresando solamente aproximadamente el 50 % de las células ARN del

plásmido en células que son fáciles de transfectar. Las eficacias de transfección para plásmidos en células primarlas son mucho más bajas, expresando menos del 10 % de las células típicamente el ARN deseado. Por lo tanto, existe la necesidad de composiciones y procedimientos alternativos para Introducir moléculas de miARN en células de modo que puedan caracterizarse y estudiarse.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico de miARN sintética que comprende una secuencia con al menos 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de miR-29 humana madura para su uso como un medicamento, incluyendo para usos en una terapia de un cáncer. También se proporciona un ácido nucleico de miARN sintético bicatenario de 17-30 nucleótidos de longitud que comprende un polinucleótido que tiene una secuencia con al menos 80 % de identidad de secuencia con una secuencia de miR-34a madura que comprende los nucleótidos 41-62 de SEC ID N°: 45, nucleótidos 51-70 de SEC ID N°:46, nucleótidos 52-71 de SEC ID N°:47 y nucleótidos 54-75 y SEC ID N°:48 y un segundo polinucleótido separado cuya secuencia de 5 a 3 es entre 60 % y 100 % complementaria del primer polinucleótido para su uso como un medicamento.

También se proporciona el uso de un ácido nucleico de miARN sintético como se ha mencionado anteriormente para reducir o aumentar la viabilidad celular o proliferación celular o para inducir o inhibir la apoptosis, a condición de que se excluyan procedimientos para el tratamiento del cuerpo humano o animal por terapia. Se definen realizaciones adicionales de la invención en las reivindicaciones. La siguiente descripción detallada se refiere a la presente invención en la medida del alcance de las reivindicaciones.

El término "miARN" se usa de acuerdo con su significado habitual y corriente y se refiere a una molécula de mlcroARN hallada en eucariotas que está implicada en la regulación génica basada en ARN. Véase, por ejemplo, Carrlngton y col., 2003, que se incorpora por la presente por referencia. En general, el término se usará... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Una molécula de ácido nucleico de miARN sintético que comprende una secuencia con al menos 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de miR-29 humana madura para su uso como un medicamento.

2. Una molécula de ácido nucleico de miARN sintético que comprende una secuencia con al menos 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de miR-29 humana madura para su uso en una terapia de un cáncer.

3. Ácido nucleico de miARN sintético para su uso como un medicamento o en una terapia de un cáncer de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 definido además como una molécula de ácido nucleico de entre 17 y 125 restos de longitud, que comprende:

una región de miARN cuya secuencia de 5 a 3 es al menos 80 % idéntica a un miARN maduro de miR-29, y

una región complementaria cuya secuencia de 5 a 3 es entre 60 % y 100 % complementaria de la región de miARN.

4. Ácido nucleico de miARN sintético para su uso como un medicamento o en una terapia de un cáncer de acuerdo con la reivindicación 1, 2 o 3, que comprende una región de miARN cuya secuencia de 5 a 3 es al menos 85 % idéntica a una secuencia de miR-29 madura.

5. Ácido nucleico de miARN sintético para su uso como un medicamento o en una terapia de un cáncer de acuerdo con la reivindicación 4, que comprende una región de miARN cuya secuencia de 5 a 3 es al menos 90 % idéntica a una secuencia de miR-29 madura.

6. Ácido nucleico de miARN sintético para su uso como un medicamento o en una terapia de un cáncer de acuerdo con la reivindicación 4 o 5, que comprende una región de miARN cuya secuencia de 5 a 3 es idéntica a una secuencia de miR-29 madura, preferentemente miR-29a o miR-29b.

7. Ácido nucleico de miARN sintético para su uso como un medicamento o en una terapia de un cáncer de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el ácido nucleico está comprendido por dos polinucleótidos separados.

8. Ácido nucleico de miARN sintético para su uso como un medicamento o en una terapia de un cáncer de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el ácido nucleico es una molécula en horquilla.

9. Ácido nucleico de miARN sintético para su uso como un medicamento o en una terapia de un cáncer de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para administración a una célula o un paciente que tiene la célula identificada como que necesita una terapia de un cáncer.

10. Ácido nucleico de miARN sintético para su uso como un medicamento o en una terapia de un cáncer de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para su uso en una terapia para tratar cáncer de tiroides, cáncer de pulmón o leucemia.

11. Un ácido nucleico de miARN sintético bicatenario de 17-30 nucleótidos de longitud que comprende un primer polinucleótido que tiene una secuencia con al menos 80 % de identidad de secuencia con una secuencia de miR-29 madura que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en los nucleótidos 41-62 de SEC ID N°: 45, nucleótidos 51-70 de SEC ID N°:46, nucleótidos 52-71 de SEC ID N°:47 y nucleótidos 54-75 y SEC ID N°:48, y un segundo polinucleótido separado cuya secuencia de 5 a 3 es entre 60 % y 100 % complementaria del primer polinucleótido para su uso como un medicamento.

12. Ácido nucleico de miARN sintético para su uso como un medicamento de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado porque el ácido nucleico se define adicionalmente como en una cualquiera de las reinvidicaciones 3 a 8.

13. Ácido nucleico de miARN sintético para su uso como un medicamento de acuerdo con las reivindicaciones 11o 12 que comprende además uno o más de los siguientes:

i) un grupo de reemplazo para fosfato o hidroxilo del nucleótido en el extremo 5 de la cadena complementaria de la molécula de ARN;

ii) una o más modificaciones de azúcares en los primeros o últimos 1 a 6 restos de la región complementaria; o

iii) no complementariedad entre uno o más nucleótidos en los últimos 1 a 5 restos en el extremo 3 de la región complementaria y los nucleótidos correspondientes de la región de miARN.

14. Ácido nucleico de miARN sintético para su uso como un medicamento de acuerdo con la reivindicación 11 o 12, que comprende i) al menos un nucleótido modificado que bloquea el 5 OH o fosfato en el extremo 5, en el que la al menos una modificación de un nucleótido es una modificación de NH2, biotina, un grupo amina, un grupo de alquilamina inferior, un grupo acetilo o 2oxígeno-metilo(20-Me) o ii) al menos una modificación de ribosa seleccionada de 2F, 2 NH2, 2N3, 4tio o 2 O-CH3.

15. Ácido nucleico de miARN sintético para su uso como un medicamento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 que es un polinucleótido bicatenario.

16. Uso de un ácido nucleico de miARN sintético como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para reducir la viabilidad celular, o disminuir la proliferación celular, o inducir o inhibir la apoptosis, con la condición

de que los procedimientos para el tratamiento del cuerpo humano o animal por cirugía o terapia estén excluidos.