Producción a gran escala de hialuronidasa soluble.

Un método para producir rHuPH20 soluble, en donde rHuPH20 soluble hace referencia a una forma soluble de PH20 humana

(también conocida como proteína de superficie de espermatozoides PH20) que es expresada recombinantemente, por ejemplo, en células de Ovario de Hámster Chino (CHO), comprendiendo el método:

a) inocular medio celular en un biorreactor con un inóculo de células que codifican rHuPH20 soluble para producir un cultivo celular, en donde:

las células comprenden entre 150 y 300 copias de ácido nucleico que codifica rHuPH20 soluble;

el biorreactor contiene al menos 100 litros de cultivo celular;

se inoculan 1010 - 1011 células por 100 litros de cultivo celular; y

las células se cultivan a una temperatura de ajuste;

b) alimentar las células con un primer medio de alimentación que contiene glucosa, L-alanil-L-glutamina, insulina humana y extracto de levadura en cantidades suficientes para incrementar el crecimiento celular y la densidad celular máxima, y para incrementar la síntesis de rHuPH20 soluble, en donde el medio de alimentación se añade al cultivo a un volumen de 0,5% a 20% del volumen de cultivo celular;

c) alimentar las células con un segundo medio de alimentación que contiene glucosa, L-alanil-L-glutamina, extracto de levadura y butirato de sodio en cantidades suficientes para incrementar la síntesis de rHuPH20 soluble e inducir la detención del ciclo celular; y

disminuir la temperatura en comparación con la temperatura de la etapa a) a una temperatura suficiente para incrementar la detección del ciclo celular, aumentar la viabilidad celular y estabilizar la hialuronidasa soluble;

en donde:

la cantidad de L-alanil-L-glutamina se reduce en comparación con la cantidad de L-alanil-L-glutamina de la etapa b);

la cantidad de extracto de levadura se incrementa en comparación con la cantidad de extracto de levadura de la etapa b); y

el medio de alimentación se añade al cultivo a un volumen de 0,5% a 20% del volumen de cultivo celular; d) alimentar las células con un tercer medio de alimentación que contiene glucosa, L-alanil-L-glutamina, extracto de levadura y butirato de sodio en cantidades suficientes para incrementar la síntesis de rHuPH20 soluble e incrementar la detención del ciclo celular, y

reducir la temperatura en comparación con la temperatura de la etapa c) a una temperatura suficiente para incrementar la detención del ciclo celular, aumentar la viabilidad celular y estabilizar la hialuronidasa soluble;

en donde:

la cantidad de L-alanil-L-glutamina se reduce en comparación con la cantidad de L-alanil-L-glutamina en la etapa c);

las cantidades de extracto de levadura, glucosa y butirato de sodio se incrementan en comparación con las cantidades de extracto de levadura, glucosa y butirato de sodio en la etapa c); y

el medio de alimentación se añade al cultivo a un volumen de 0,5% a 20% del volumen del cultivo celular; e) alimentar la células con un cuarto medio de alimentación que contiene glucosa, L-alanil-L-glutamina, extracto de levadura y butirato de sodio en cantidades suficientes para incrementar la síntesis de rHuPH20 soluble e incrementar la detención del ciclo celular, y

disminuir la temperatura en comparación con la temperatura en la etapa d) a una temperatura suficiente para incrementar la detención del ciclo celular, incrementar la viabilidad celular y estabilizar la hialuronidasa soluble; en donde:

la cantidad de L-alanil-L-glutamina y glucosa se reducen en comparación con la cantidad de L-alanil-L45 glutamina y glucosa de la etapa d);

la cantidad de butirato de sodio se reduce en comparación con la cantidad de butirato de sodio en la etapa d);

y

el medio de alimentación se añade al cultivo a un volumen de 0,5% a 20% del volumen de cultivo celular;

f) continuar cultivando las células hasta que la viabilidad cae por debajo de al menos 50%;

g) obtener el líquido de cultivo de la cosecha; y

h) purificar la rHuPH20 del líquido de cultivo celular de la cosecha.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2009/001455.

Solicitante: HALOZYME, INC.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 11388 SORRENTO VALLEY ROAD SAN DIEGO, CA 92121 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: BAKER, DAVID, BOOKBINDER,LOUIS.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones... > C12N9/26 (actúan sobre enlaces alfa-glucosídicos-1, 4, p. ej. hialuronidasa, invertasa, amilasa)

PDF original: ES-2537340_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Producción a gran escala de hialuronidasa soluble Campo de la invención

Se proporcionan métodos para la producción a gran escala de una proteína humana recombinante.

Antecedentes

Las hialuronidasas son una familia de enzimas que degradan el ácido hialurónico (también conocido como hialuronano o hialuronato), un componente esencial de la matriz extracelular y un constituyente principal de la barrera intersticial. Al catalizar la hidrólisis de ácido hialurónico, la hialuronidasa reduce la viscosidad del ácido hialurónico, lo que aumenta la permeabilidad del tejido. Como tales, se han utilizado hialuronidasas, por ejemplo, como un agente de diseminación o de dispersión junto con otros agentes, fármacos y proteínas para mejorar su dispersión y liberación. Las hialuronidasas también tienen otros usos terapéuticos y cosméticos. Debido a la creciente utilización de hialuronidasas para usos terapéuticos y cosméticos, hay una necesidad de cantidades a gran escala de hialuronidasa purificada. Por lo tanto, entre los objetos de la presente memoria, existe el objeto de proporcionar métodos para la producción y purificación de hialuronidasas.

La Publicación de los Estados Unidos Núm. 2426825 describe glicoproteínas hialuronidasas activas neutras solubles (sHASECP), incluyendo formas solubles de PH2 humana (sHuPH2). Los métodos para la producción de sHASEGP se describen, pero no se extienden a la producción a gran escala de hialuronidasas solubles.

Compendio

En la presente memoria se proporcionan métodos para la producción y purificación de rHuPH2 soluble. Los métodos proporcionados en este documento se pueden utilizar para producir y purificar cualquier cantidad de rHuPH2 soluble. Por ejemplo, los métodos y etapas descritos en la presente memoria son modificables para el aumento de la escala o la disminución de la escala, como sería evidente para un experto en la técnica.

En un primer aspecto, la invención proporciona un método para producir rHuPH2 soluble, en donde rHuPH2 soluble se refiere a una forma soluble de PH2 humana (también conocida como proteína PH2 de la superficie de espermatozoides) que se expresa de forma recombinante por ejemplo en células de ovario de hámster chino (CHO), comprendiendo el método:

a) inocular medio celular en un biorreactor con un inoculo de células que codifican rHuPH2 soluble para producir un cultivo celular, en donde:

las células comprenden entre 15 y 3 copias de ácido nucleico que codifica rHuPH2 soluble; el biorreactor contiene al menos 1 litros de cultivo celular; se inoculan 11 -111 células por 1 litros de cultivo celular; y las células se cultivan a una temperatura de ajuste;

b) alimentar las células con un primer medio de alimentación que contiene glucosa, L-alanil-L-glutamina, insulina humana y extracto de levadura en cantidades suficientes para aumentar el crecimiento celular y la densidad de células máxima, y para aumentar la síntesis de rHuPH2 soluble, en donde el medio de alimentación se añade al cultivo en un volumen de ,5% a 2% del volumen de cultivo celular;

c) alimentar las células con un segundo medio de alimentación que contienen glucosa, L-alanil-L-glutamina, extracto de levadura y butirato de sodio en cantidades suficientes para aumentar la síntesis de rHuPH2 soluble e inducir la detención del ciclo celular; y

reducir la temperatura en comparación con la temperatura en la etapa a) a una temperatura suficiente para aumentar la detención del ciclo celular, aumentar la viabilidad celular y estabilizar la hialuronidasa soluble; en donde:

la cantidad de L-alanil-L-glutamina se reduce en comparación con la cantidad de L-alanil-L-glutamina de la etapa b);

la cantidad de extracto de levadura aumenta en comparación con la cantidad de extracto de levadura de la etapa b); y

se añade el medio de alimentación al cultivo en un volumen de ,5% a 2% del volumen de cultivo celular;

d) alimentar las células con un tercer medio de alimentación que contienen glucosa, L-alanil-L-glutamina, extracto de levadura y butirato de sodio en cantidades suficientes para aumentar la síntesis de rHuPH2 soluble y aumentar la detención del ciclo celular, y

reducir la temperatura en comparación con la temperatura en la etapa c) a una temperatura suficiente para aumentar la detención del ciclo celular, aumentar la viabilidad celular y estabilizar la hialuronidasa soluble; en donde:

la cantidad de L-alanil-L-glutamina se reduce en comparación con la cantidad de L-alanil-L-glutamina de la etapa c);

las cantidades de extracto de levadura, glucosa y butirato de sodio aumentan en comparación con las

cantidades de extracto de levadura, glucosa y butirato de sodio de la etapa c); y

se añade el medio de alimentación al cultivo en un volumen de ,5% o al 2% del volumen de cultivo

celular;

e) alimentar las células con un cuarto medio de alimentación que contienen glucosa, L-alanil-L-glutamina, extracto de levadura y butirato de sodio en cantidades suficientes para aumentar la síntesis de rHuPH2 soluble y aumentar la detención del ciclo celular, y

reducir la temperatura en comparación con la temperatura de la etapa d) a una temperatura suficiente para aumentar la detención del ciclo celular, aumentar la viabilidad celular y estabilizar la hialuronidasa soluble; en donde:

la cantidad de L-alanil-L-glutamina y la glucosa se reduce en comparación con la cantidad de L-alanil- L-glutamina y glucosa de la etapa d);

la cantidad de butirato de sodio se reduce en comparación con la cantidad de butirato de sodio de la etapa d); y

se añade el medio de alimentación al cultivo en un volumen de ,5% a 2% del volumen de cultivo celular;

f) continuar cultivando las células hasta que la viabilidad cae por debajo de al menos 5%;

g) obtener el líquido de cultivo celular recolectado; y

h) purificar rHuPH2 del fluido del cultivo celular recolectado.

El líquido de cultivo celular recolectado se puede filtrar antes de la purificación. En algunos ejemplos, la temperatura en la etapa a) es de 37°C, la temperatura en la etapa c) es 36,5°C, la temperatura en la etapa d) es de 36°C y la temperatura en la etapa d) es 35,5°C. La purificación de rHuPH2 soluble se puede efectuar mediante cromatografía en columna, tal como cromatografía en columna con cuentas de agarosa entrecruzada, cromatografía en columna con cuentas de agarosa sustituida con fenilo entrecruzada, cromatografía en columna con aminofenilboronato y cromatografía en columna con hidroxlapatita.

En un ejemplo, el método para producir rHuPH2 soluble de acuerdo con el primer aspecto de la invención indicado anteriormente, incluye las etapas (a) a (h) en donde: en la etapa a), las células se cultivan a 37°C;

en la etapa b) del primer medio de alimentación contiene 33 g/L de glucosa, L-alanil-L-glutamina 32 mM, 16,6 g/L de extracto de levadura y 33 mg/L de insulina, y el medio de alimentación se añade al cultivo a un volumen de 4% del volumen de cultivo celular;

en la etapa c) el segundo medio de alimentación contiene 33 g/L de glucosa, L-alanil-L-glutamina 16 mM, 33,4 g/L de extracto de levadura y ,92 g/L de butirato de sodio, y el medio de alimentación se añade a la de cultivo a un volumen de 4% del volumen de cultivo celular; y la temperatura se reduce a 36,5°C;

en la etapa d) el tercer medio de alimentación contiene 5 g/L de glucosa, L-alanil-L-glutamina 1 mM, 5 g/L de extracto de levadura y 1,8 g/L de butirato de sodio, y el medio de alimentación se añade al cultivo a un volumen de 4% del volumen de cultivo celular; y la temperatura se reduce a 36°C;

en la etapa e) el cuarto medio de alimentación contiene 33 g/L de glucosa,... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para producir rHuPH2 soluble, en donde rHuPH2 soluble hace referencia a una forma soluble de PH2 humana (también conocida como proteína de superficie de espermatozoides PH2) que es expresada recomblnantemente, por ejemplo, en células de Ovario de Hámster Chino (CHO), comprendiendo el método:

a) Inocular medio celular en un biorreactor con un inoculo de células que codifican rHuPH2 soluble para producir un cultivo celular, en donde:

las células comprenden entre 15 y 3 copias de ácido nucleico que codifica rHuPH2 soluble; el biorreactor contiene al menos 1 litros de cultivo celular; se inoculan 11 -111 células por 1 litros de cultivo celular; y las células se cultivan a una temperatura de ajuste;

b) alimentar las células con un primer medio de alimentación que contiene glucosa, L-alanil-L-glutamina, insulina humana y extracto de levadura en cantidades suficientes para incrementar el crecimiento celular y la densidad celular máxima, y para incrementar la síntesis de rHuPH2 soluble, en donde el medio de alimentación se añade al cultivo a un volumen de ,5% a 2% del volumen de cultivo celular;

c) alimentar las células con un segundo medio de alimentación que contiene glucosa, L-alanil-L-glutamina, extracto de levadura y butirato de sodio en cantidades suficientes para incrementar la síntesis de rHuPH2 soluble e inducir la detención del ciclo celular; y

disminuir la temperatura en comparación con la temperatura de la etapa a) a una temperatura suficiente para incrementar la detección del ciclo celular, aumentar la viabilidad celular y estabilizar la hialuronidasa soluble; en donde:

la cantidad de L-alanil-L-glutamina se reduce en comparación con la cantidad de L-alanil-L-glutamina de la etapa b);

la cantidad de extracto de levadura se incrementa en comparación con la cantidad de extracto de levadura de la etapa b); y

el medio de alimentación se añade al cultivo a un volumen de ,5% a 2% del volumen de cultivo celular;

d) alimentar las células con un tercer medio de alimentación que contiene glucosa, L-alanil-L-glutamina, extracto de levadura y butirato de sodio en cantidades suficientes para incrementar la síntesis de rHuPH2 soluble e incrementar la detención del ciclo celular, y

reducir la temperatura en comparación con la temperatura de la etapa c) a una temperatura suficiente para incrementar la detención del ciclo celular, aumentar la viabilidad celular y estabilizar la hialuronidasa soluble; en donde:

la cantidad de L-alanil-L-glutamina se reduce en comparación con la cantidad de L-alanil-L-glutamina en la etapa c);

las cantidades de extracto de levadura, glucosa y butirato de sodio se incrementan en comparación con las cantidades de extracto de levadura, glucosa y butirato de sodio en la etapa c); y

el medio de alimentación se añade al cultivo a un volumen de ,5% a 2% del volumen del cultivo celular;

e) alimentar la células con un cuarto medio de alimentación que contiene glucosa, L-alanil-L-glutamina, extracto de levadura y butirato de sodio en cantidades suficientes para incrementar la síntesis de rHuPH2 soluble e incrementar la detención del ciclo celular, y

disminuir la temperatura en comparación con la temperatura en la etapa d) a una temperatura suficiente para incrementar la detención del ciclo celular, incrementar la viabilidad celular y estabilizar la hialuronidasa soluble; en donde:

la cantidad de L-alanil-L-glutamina y glucosa se reducen en comparación con la cantidad de L-alanil-L- glutamina y glucosa de la etapa d);

la cantidad de butirato de sodio se reduce en comparación con la cantidad de butirato de sodio en la etapa d);

y

el medio de alimentación se añade al cultivo a un volumen de ,5% a 2% del volumen de cultivo celular;

f) continuar cultivando las células hasta que la viabilidad cae por debajo de al menos 5%;

g) obtener el líquido de cultivo de la cosecha; y

h) purificar la rHuPH2 del líquido de cultivo celular de la cosecha.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la temperatura en la etapa a) es de 37°C.

3. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la temperatura en la etapa c) es de 36,5°C.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la temperatura en la etapa d) es de 36°C.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la temperatura en la etapa e) es de 35,5°C.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el líquido de cultivo celular de la cosecha se filtra antes de la purificación.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde la purificación de rHuPH2 soluble se lleva a cabo mediante cromatografía en columna.

8. El método de la reivindicación 7, en donde la cromatografía en columna comprende cromatografía en columna de cuentas de agarosa entrecruzada, cromatografía en columna de cuentas de agarosa sustituida con fenllo entrecruzada, cromatografía en columna de amino fenil boronato o cromatografía en columna de hidroxiapatita.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde el medio de alimentación se añade al cultivo a un volumen de 4% del volumen de cultivo celular.

1. El método de la reivindicación 1, en donde:

en la etapa a) las células se cultivan a 37°C;

en la etapa b) el primer medio de alimentación contiene 33 g/L de glucosa, L-alanil-L-glutamina 32 mM, 16,6 g/L de extracto de levadura y 33 mg/L de insulina, y el medio de alimentación se añade al cultivo a un volumen de 4% del volumen de cultivo celular;

en la etapa c) el segundo medio de alimentación contiene 33 g/L de glucosa, L-alanll-L-glutamlna 16 mM, 33,4 g/L de extracto de levadura y ,92 g/L de butirato de sodio, y el medio de alimentación se añade al cultivo a un volumen de 4% del volumen de cultivo celular; y la temperatura se reduce a 36,5°C;

en la etapa d) el tercer medio de alimentación contiene 5 g/L de glucosa, L-alanil-L-glutamlna 1 mM, 5 g/L de extracto de levadura y 1,8 g/L de butirato de sodio, y el medio de alimentación se añade al cultivo a un volumen de 4% del volumen de cultivo celular; y la temperatura se reduce a 36°C;

en la etapa e) el cuarto medio de alimentación contiene 33 g/L de glucosa, L-alanil-L-glutamina 6,6 mM, 5 g/L de extracto de levadura y ,92 g/L de butirato de sodio, y el medio de alimentación se añade al cultivo a un volumen de 4% del volumen de cultivo celular; y

la temperatura se reduce a 35,5°C; comprendiendo adiclonalmente filtrar el líquido de cultivo celular de la cosecha obtenido en la etapa g) y

en la etapa h) purificar la rHuPH2 del líquido de cultivo de la cosecha utilizando cromatografía en columna de cuentas de agarosa entrecruzada, cromatografía en columna de cuentas de agarosa sustituida con fenllo entrecruzada, cromatografía en columna de amino fenil boronato o cromatografía en columna de hidroxiapatita.

11. El método de la reivindicación 1, en donde:

en la etapa a) las células se inoculan a una densidad celular de 4 x 15 células/mL; y las células se cultivan a 37°C;

en la etapa b) el primer medio de cultivo contiene 33 g/L de glucosa, L-alanil-L-glutamlna 32 mM, 83,3 g/L de extracto de levadura y 33 mg/L de insulina, y el medio de alimentación se añade al cultivo a un volumen de 4% del volumen de cultivo celular;

en la etapa c) el segundo medio de alimentación contiene 33 g/L de glucosa, L-alanil-L-glutamina 13 mM, 166,7 g/L de extracto de levadura y ,92 g/L de butirato de sodio, y el medio de alimentación se añade al cultivo a un volumen de 4% del volumen de cultivo celular; y la temperatura se reduce a 36,5°C;

en la etapa d) el tercer medio de alimentación contiene 5 g/L de glucosa, L-alanil-L-glutamlna 1 mM, 25 g/L de extracto de levadura y 1,8 g/L de butirato de sodio, y el medio de alimentación se añade al cultivo a un volumen de 4% del volumen de cultivo celular; y la temperatura se reduce a 36°C;

en la etapa e) el cuarto medio de alimentación contiene 33 g/L de glucosa, L-alanil-L-glutamlna 6,7 mM, 25 g/L de extracto de levadura y ,92 g/L de butirato de sodio, y el medio de alimentación se añade al cultivo a un volumen de 4% del volumen de cultivo celular; y la temperatura se reduce a 35,5 °C; que comprende adiclonalmente filtrar el líquido de cultivo celular de la cosecha obtenido en la etapa g) y

en la etapa h) purificar la rHuPH2 del líquido de cultivo de la cosecha utilizando cromatografía en columna de cuentas de agarosa entrecruzada, cromatografía en columna de cuentas de agarosa sustituida con fenilo entrecruzada, cromatografía en columna de amino fenil boronato o cromatografía en columna de hidroxiapatita.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde se producen al menos ,5, 1, 5, 1, 15, 2, 25, 3, 35 o 4 gramos de rHuPH2 soluble por 1 L de cultivo celular.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde la actividad específica de la rHuPH2 soluble es de al menos 8., 1., 12., 14., 16. o 18. unidades/mg.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en donde el volumen de cultivo celular en el blorreactor es de 2, 3, 4, 5, 1., 1.5, 2., 2.5, 3. o 3.5 litros.

15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en donde las células que codifican la rHuPH2 soluble 5 son células CHO DG44.

16. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, en donde la rHuPH2 está codificada por el ácido nucleico mostrado en el SEQ ID NO: 47.

17. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en donde la secuencia de la rHuPH2 codificada por

las células comprende un polipéptido cuya secuencia se muestra en cualquiera de los SEQ ID NO 4-9 o variantes del mismo que tienen una identidad de secuencia de 6%, 7%, 8%, 85%, 9%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más con cualquiera de los SEQ NO. 4-9 y que conservan una actividad hialuronidasa y son solubles.