OB-fold usado como estructura para diseño por ingeniería de nuevos agentes de unión específicos.

Una biblioteca combinatoria de variantes de una proteína OB-fold, en la que de 5 a 32

, preferiblemente de 8 a 20, y más preferiblemente de 11 a 16 restos de la interfaz de unión de una proteína OB-fold con su ligando nativo se han sustituido aleatoriamente, en la que dicha proteína OB-fold es Sac7d o Sac7e de Sulfolobus acidocaldarius, o Sso7d, de Sulfolobus solfataricus, o DBP 7 de Sulfolobus tokodaii, o Ssh7b de Sulfolobus shibatae, o Ssh7a de Sulfolobus shibatae, o p7ss de Sulfolobus solfataricus, en la que dichos restos que se aleatorizan en dichas variantes se seleccionan entre los restos correspondientes a V2, K3, K5, K7, Y8, K9, G10, E14, T17, K21, K22, W24, V26, G27, K28, M29, S31, T33, D36, N37, G38, K39, T40, R42, A44, S46, E47, K48, D49, A50 y P51 de Sac7d.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/IB2007/004388.

Solicitante: INSTITUT PASTEUR.

Inventor/es: ALZARI,PEDRO, PECORARI,FRÉDÉRIC.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/10 (Procedimientos para el aislamiento, la preparación o la purificación de ADN o ARN (preparación química de ADN o ARN C07H 21/00; preparación de polinucleótidos no estructurales a partir de microorganismos o con la ayuda de enzimas C12P 19/34))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas;... > C07K14/195 (de origen bacteriano)

PDF original: ES-2536509_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

OB-Fold usado como estructura para diseño por ingeniería de nuevos agentes de unión específicos

La presente invención se refiere al campo de la ingeniería de proteínas. Más específicamente, la invención proporciona un medio para obtener moléculas estables que se unan específicamente a una diana seleccionada entre una amplia diversidad de familias de ligandos.

La mayoría de las proteínas naturales no están adaptadas a usos terapéuticos o incluso biotecnológicos. El reto de la ingeniería de proteínas es definir modos eficaces y extensivos para el diseño de proteínas nuevas o mejoradas con las propiedades requeridas. Entre las propiedades abordadas, el reconocimiento de un ligando con alta especificidad y afinidad es de suprema importancia. Para muchas aplicaciones, se han usado anticuerpos a causa de extraordinaria adaptabilidad a la unión con muchos tipos diferentes de ligandos, tales como proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, azucares, etc. Sin embargo, los anticuerpos o sus fragmentos derivados a menudo son difíciles y caros de producir a causa de su complejidad molecular y/o su insuficiente estabilidad. Por estas razones, recientemente se han desarrollado alternativas a los anticuerpos usando proteínas estructurales modificadas por ingeniería mediante un enfoque de mutación combinatoria/selección. El objetivo fue mantener las propiedades favorables de los anticuerpos, eliminando al mismo tiempo sus desventajas. Se ha informado de las aplicaciones satisfactorias de esta estrategia (Binz et al., 2005; Mathonet y Fastrez 2004), siendo la inmensa mayoría de las dianas proteínas y, excepcionalmente, compuestos orgánicos pequeños.

La presente invención está dirigida a proporcionar herramientas para modificar por ingeniería moléculas bien adaptadas a usos médicos o biotecnológicos, y capaces de unirse específicamente y con alta afinidad a diversas dianas, seleccionadas entre ácidos nucleicos, proteínas, carbohidratos y cualquier otra molécula biológica. Para este objetivo, los inventores han ensayado la hipótesis de que una estructura proteica particular, llamada plegamiento de unión a oligonucleótido/oligosacárido (OB-foid), podría modificarse por aleatorización de los restos de su cara de unión, manteniendo al menos parcialmente al mismo tiempo las propiedades biofísicas favorables de la proteína precursora (es decir, alta estabilidad y eficacia de plegamiento).

El plegamiento de unión a oligonucleótido/oligosacárido (OB-foid), se describió por primera vez por Murzin (Murzin, 1993), se encuentra en todos los reinos y se clasificó como el 28° plegamiento más representado en un compendio de 20 genomas (Qlan et al., 2001). Este plegamiento, un barril-p de cinco hebras encapsulado con una a-hélice anfíflla, parece adecuado para una amplia diversidad de secuencias. El OB-foid presenta una cara de unión de lámlna-p que confiere diversidad remarcable en los tipos de compuestos que pueden reconocerse: ADNmc, ADNbc, ARN, ollgosacárldos, proteínas, Iones metálicos y sustratos catalíticos. Un estudio de varios OB-foid de diferentes proteínas mostró que el núcleo de unión está siempre localizado en la misma posición de la cara de unión (Arcus, 2002).

Sac7d tiene una topología OB-foid (figura 1a) (Agbaek et al., 1998; Gao et al., 1998; Robinson et al., 1998; Su et al., 2000). Pertenece a una clase de pequeñas proteínas cromosómlcas de la archaea hipertermófila Su/fo/obus ac/doca/dar/us. Sac7d se une a ADN blcatenarlo sin ninguna preferencia de secuencia particular, induciendo al mismo tiempo una aguda torsión en el ADN (Robinson et al., 1998). Se cree que desempeña un papel en la estabilización de la hélice de ADN a alta temperatura de crecimiento de Su/fo/obus ac/doca/dar/us (óptima a 85°C). Sac7d es extremadamente estable. Es termoestable y se despliega con una Tm de 91 °C, mantiene un plegamiento nativo entre pH 0 y 10, y su desnaturalización Inducida por clorhidrato de guanldlnlo sucede de forma reversible con una concentración de punto medio de 2,8 M de desnaturalizante (McCrary et al., 1996). Contrario a los anticuerpos, su organización molecular es bastante simple. Sac7d es una proteína monomérlca pequeña de 66 aminoácidos, con un dominio estructural (es decir, el OB-foid), y no tiene un enlace disulfuro (McAfee et al., 1995). Se han observado varias formas truncadas de Sac7d (McAfee et al., 1995). Pueden alcanzarse niveles de sobreproducción de hasta 10-15 mg de proteína soluble por litro de cultivo en matraz de Fscber/cb/a co// (Edmondson y Shrlver, 2001). Estudios estructurales de Sac7d y su homólogo cercano Sso7d de Su/fo/obus so/fafar/cus han demostrado que los dos núcleos proteicos son superponlbles y que la unión al surco menor del ADN sucede principalmente mediante un área girada formada por 16 restos (Agbaek et al., 1998; Gao et al., 1998; Robinson et al., 1998).

Los Inventores han explorado la posibilidad de cambiar la especificidad de unión de Sac7d por evolución proteica dirigida /n v/fro, a través de la Introducción de mutaciones aleatorias en varios restos Implicados en la unión a ligando, seguido por una selección de vahantes que se unen a una diana dada. De forma más precisa, los Inventores han construido una gran biblioteca de aproximadamente 3x10^ variantes correspondientes a sustituciones aleatorias de 11 restos de la Interfaz de unión de SAc7d. Esta biblioteca se ha usado para seleccionar vahantes capaces de unirse a una diana proteica definida, por presentación en rlbosoma. Se obtuvieron combinaciones de agentes de unión para tres dianas proteicas, con afinidades en el Intervalo de cien nanomolar. En un segundo enfoque, los Inventores ampliaron el área de unión potencial hasta 13 y 14 restos. Estas nuevas bibliotecas se usaron para la selección sobre una de las dianas previas (PulD-N), y se obtuvieron agentes de unión específica con afinidad en el Intervalo plcomolar. Por tanto, los Inventores han demostrado que, sorprendentemente, un agente de unión general a ADN (Sac7d) puede Ir evolucionando hacia un agente de unión específico a proteína que tiene alta especificidad y afinidad. Esta demostración proporciona una prueba del principio de que los agentes

de unión para casi cualquier tipo de ligando pueden obtenerse de Sac7d u otras proteínas OB-fold, por ejemplo usando los procesos descritos en más detalle a continuación.

Un primer aspecto de la presente solicitud describe el uso de una proteina OB-fold, como molécula de partida para obtener, a través de un enfoque de mutación combinatoria/selección, una molécula que se una específicamente a una diana, especialmente a una diana a la cual no se une la proteina OB-fold de partida, es decir, a una diana diferente de la diana de la proteina OB-fold usada como la molécula de partida. A continuación, la diana de la proteina OB-fold de partida se llamará la "diana nativa", mientras que la diana usada en la etapa de selección se denominará como "diana de interés". En una realización preferida, la diana de interés es de una naturaleza química diferente de la de la diana nativa (por ejemplo, proteina frente a ácido nucleico, e ión metálico o azúcar frente a proteina). Un aspecto particular de la presente solicitud describe el uso de una proteina OB-fold que se une de forma natural a un ácido nucleico, como molécula de partida para obtener, a través de un enfoque de mutación combinatoria/selección, una molécula que se una específicamente a una diana diferente de un ácido nucleico (por ejemplo, una proteina). El uso de una proteina OB-fold que se una de forma natural a una proteina, como molécula de partida para obtener, a través de un enfoque de mutación combinatoria/selección, una molécula que se una específicamente a una diana no proteica (por ejemplo, un ácido nucleico)... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Una biblioteca combinatoria de variantes de una proteína OB-foId, en la que de 5 a 32, preferiblemente de 8 a 20, y más preferiblemente de 11 a 16 restos de la interfaz de unión de una proteína OB-foId con su ligando nativo se han sustituido aleatoriamente, en la que dicha proteína OB-foId es Sac7d o Sac7e de Su//b/o¡bus ac/doca/dar/us, o Sso7d, de Su/fo/oóus so/fafar/cus, o DBP 7 de Su/fo/obus fo/roda//, o Ssh7b de Su/fo/obus sb/bafae, o Ssh7a de Su/fo/obus sb/bafae, o p7ss de Su/fo/obus so/fafabcus, en la que dichos restos que se aleatorizan en dichas vahantes se seleccionan entre los restos correspondientes a V2, K3, K5, K7, Y8, K9, G10, E14, T17, K21, K22, W24, V26, G27, K28, M29, S31, T33, D36, N37, G38, K39, T40, R42, A44, S46, E47, K48, D49, A50 y P51 de Sac7d.

2. La biblioteca combinatoria de la reivindicación 1, en la que dichas variantes comprenden adicionalmente una inserción de 1 a 15 restos aminoacídicos aleatorios en el bucle 3 y/o una inserción de 1 a 15 restos aminoacídicos aleatorios en el bucle 4, y/o una inserción de 1 a 20 restos aminoacídicos aleatorios en el bucle 1.

3. La biblioteca combinatoria de la reivindicación 1 o 2, en la que 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18 restos se aleatorizan, elegidos entre los restos correspondientes a K7, Y8, K9, K21, K22, W24, V26, K28, M29, S31, T33, K39, T40, R42, A44, S46, E47 y K48 de Sac7d.

4. La biblioteca combinatoria de la reivindicación 3, en la que 11, 12, 13, 14, 15 o 16 restos se aleatorizan, elegidos entre los restos correspondientes a K7, Y8, K9, K21, K22, VV24, V26, K28, M29, S31, T33, K39, T40, R42, A44 y S46 de Sac7d.

5. La biblioteca combinatoria de la reivindicación 4, en la que los restos aleatorizados en dichas variantes comprenden al menos los restos correspondientes a K7, Y8, K9, W24, V26, M29, S31, T33, R42, A44 y S46 de Sac7d.

6. La biblioteca combinatoria de la reivindicación 5, en la que solamente los restos correspondientes a K7, Y8, K9, W24, V26, M29, S31, T33, R42, A44 y S46 de Sac7d se aleatorizan en dichas variantes.

7. La biblioteca combinatoria de la reivindicación 6, en la que uno, dos o tres restos adicionales seleccionados entre los correspondientes a K21, K22 y T40 de Sac7d se aleatorizan también en dichas variantes.

8. La biblioteca combinatoria de la reivindicación 7, en la que los restos correspondientes a K7, Y8, K9, K21, K22, W24, V26, M29, S31, T33, R42, A44 y S46 de Sac7d se aleatorizan en dichas variantes.

9. La biblioteca combinatoria de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que de 1 a 15 restos aminoacídicos aleatorios se insertan en la región correspondiente a los aminoácidos en la posición 25 a 30 de Sac7d, preferiblemente entre G27 y K28, y/o de 1 a 15 restos aminoacídicos aleatorios se insertan en la región correspondiente a los aminoácidos en la posición 35 a 40 de Sac7d, preferiblemente entre N37 y G38, y/o de 1 a 20 restos aminoacídicos aleatorios se insertan en la región correspondiente a los aminoácidos en la posición 7 a 12 de Sac7d, preferiblemente entre K9 y G10 en dichas variantes.

10. La biblioteca combinatoria de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que de 1 a 4 restos aminoacídicos seleccionados entre los restos correspondientes a A59, R60, A61 y E64 de Sac7d se delecionan en dichas vahantes.

11. Un proceso para obtener una molécula que se una específicamente a una diana de interés, que comprende una etapa de selección y aislamiento, en una biblioteca combinatoria de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, de una o vahas variantes de dicha proteína OB-foId que se une a dicha diana de interés.

12. El proceso de la reivindicación 11, en el que dicha diana es un péptido, una proteína, un oligosacárido, un ADN monocatenario, un ADN bicatenario, un ARN, un ión metálico, o un carbohidrato.

13. El proceso de la reivindicación 11 o 12, en el que dicha etapa de selección se realiza por presentación en ribosoma.

14. El proceso de la reivindicación 13, en el que se realizan 2, 3, 4 o 5 rondas de selección por presentación en ribosoma.

15. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, que comprende adicionalmente una etapa de caracterización de una molécula que se une específicamente a dicha diana.

16. El proceso de la reivindicación 15, en el que dicha etapa de aislamiento y caracterización comprende las siguientes etapas:

(¡) se transcriben de forma inversa los ARNm de una combinación seleccionada por presentación en ribosoma y se amplifican por PCR, y los ADN resultantes se clonan en vectores de expresión;

(¡i) se transforman bacterias por dichos vectores de expresión y se cultivan clones Individuales; y (¡II) se ensayan las proteínas extraídas de dichos clones bacterianos para su unión a la diana.

17. Una proteína, caracterizada porque se une específicamente a GarA, y porque su secuencia es la SEC ID N° 47.

18. Un complejo que consiste en una variante de una proteína OB-foId de partida en el que de 5 a 32 restos en la interfaz de unión de dicha proteína OB-foId de partida con su ligando nativo se han sustituido, en el que dicha variante se une a una diana a la que no se une la proteína OB-foId de partida, en el que dicha proteína OB-foId de partida se elige entre Sac7d o Sac7e de Su/fo/obus ac/doca/dar/us, Sso7d, de Su/fb/obus so/fafar/cus, DBP 7 de Su/fo/obus fo/roda/7, Ssh7b de Su/fo/obus sb/bafae, Ssh7a de Su/fo/obus sb/bafae, y p7ss de Su/fo/obus so/Zafar/cus, en el que dichos restos sustituidos corresponden a los restos de Sac7d seleccionados entre V2, K3, K5, K7, Y8, K9, G10, E14, T17, K21, K22, W24, V26, G27, K28, M29, S31, T33, D36, N37, G38, K39, T40, R42, A44, S46, E47, K48, D49, A50y P51.

19. El complejo de la reivindicación 18, en el que dicha variante comprende adicionalmente la inserción de 1 a 15 restos aminoacídicos aleatorios en la región correspondiente a los aminoácidos en la posición 25 a 30 de Sac7d, preferiblemente entre G27 y K28, y/o al inserción de 1 a 15 restos aminoacídicos aleatorios en la región correspondiente a los aminoácidos en la posición 35 a 40 de Sac7d, preferiblemente entre N37 y G38, y/o la inserción de 1 a 20 restos aminoacídicos aleatorios en la región correspondiente a los aminoácidos en la posición 7 a 12 de Sac7d, preferiblemente entre K9 y G10.

20. El complejo de cualquiera de las reivindicaciones 18 o 19, en el que 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18 restos seleccionados entre los restos correspondientes a K7, Y8, K9, K21, K22, W24, V26, K28, M29, S31, T33, K39, T40, R42, A44, S46, E47 y K48 de Sac7d están sustituidos en dicha vahante respecto a la proteína OB-foId de partida.