Enzimas lecitina-colesterol aciltransferasa modificadas.

Proteína lecitina-colesterol aciltransferasa (LCAT) modificada,

en la que

la proteína LCAT modificada comprende una modificación en la secuencia de aminoácidos de LCAT madura expuesta en SEQ ID NO: 1; o SEQ ID NO: 2 tal como se expone en la figura 2; y

la modificación consiste en una sustitución en el residuo de aminoácido C31 seleccionada del grupo que consiste en C31I, C31M, C31F, C31V, C31W, C31Y, C31R y C31H.

Enzimas lecitina-colesterol aciltransferasa modificadas.

Campo de la invención Esta invención se refiere en general al campo de la medicina y, más específicamente, a composiciones y a métodos para tratar cardiopatía coronaria, aterosclerosis, trastornos inflamatorios y trastornos asociados con trombosis.

Antecedentes de la invención Más de 50 millones de estadounidenses tienen problemas cardiovasculares, y muchos otros países se enfrentan a tasas altas y crecientes de enfermedad cardiovascular. Es la causa número uno de muerte y discapacidad en los Estados Unidos y la mayoría de los países europeos. En el momento en el que se detectan problemas cardiacos, la causa subyacente, la aterosclerosis, habitualmente está bastante avanzada, habiendo progresado durante décadas.

La aterosclerosis es una enfermedad compleja poligénica de mamíferos caracterizada por los depósitos o placas de lípidos y otros derivados sanguíneos en las paredes arteriales (aorta, arterias coronarias y carótida) . Estas placas pueden estar calcificadas en un mayor o menor grado según la progresión del proceso. También están asociadas con la acumulación de depósitos grasos que consisten principalmente en ésteres de colesterol en las arterias. El colesterol se acumula en las células espumosas de la pared arterial, estrechando de ese modo la luz y disminuyendo el flujo de sangre. Esto va acompañado por un engrosamiento de la pared arterial, con hipertrofia del músculo liso, la aparición de células espumosas y la acumulación del tejido fibroso. Por tanto, la hipercolesterolemia puede dar como resultado patologías cardiovasculares muy graves tales como infarto, enfermedad vascular periférica, accidente cerebrovascular, muerte súbita, descompensación cardiaca, accidentes vasculares cerebrales y similares.

El colesterol se porta en la sangre por diversas lipoproteínas incluyendo las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) , las lipoproteínas de baja densidad (LDL) y las lipoproteínas de alta densidad (HDL) . Las VLDL se sintetizan en el hígado y se convierten en LDL en la sangre, lo que hace posible suministrar colesterol a los tejidos periféricos. En cambio, las HDL capturan moléculas de colesterol de los tejidos periféricos y las transportan al hígado en el que se convierten en ácidos biliares y se excretan. El desarrollo de aterosclerosis y el riesgo de cardiopatía coronaria (CPC) se correlacionan de manera inversa con los niveles de HDL en el suero. Gordon et al. (1989) N. Engl. J. Med.

321: 1311; Goldbourt et al. (1997) Thromb Vasc. Biol. 17: 107. Se producen a menudo bajos niveles de colesterol HDL en el contexto de obesidad central, diabetes y otras características del síndrome metabólico. Goldbourt et al., citado anteriormente. Se ha sugerido que bajos niveles de colesterol HDL están asociados con un aumento del riesgo de CPC, mientras que altas concentraciones de HDL tienen un efecto protector frente al desarrollo de aterosclerosis prematura. Gordon et al. (1986) Circulation 74: 1217. Estudios demostraron que el riesgo de desarrollo de aterosclerosis clínica en hombres desciende un 2-3% con cada aumento de 1 mg/dl en la concentración de HDL en plasma. Gordon et al. (1989) N. Engl. J. Med. 321: 1311. Se ha establecido que pueden reducirse las concentraciones de colesterol LDL mediante tratamiento con estatinas, inhibidores de la enzima de biosíntesis de colesterol 3-hidroxil-3-metilglutaril coenzima A reductasa y de ese modo este tratamiento se ha usado como enfoque satisfactorio para reducir el riesgo de aterosclerosis cuando la indicación primaria es un nivel de LDL alto. Sin embargo, sigue estando poco claro si las estatinas son beneficiosas para pacientes cuya anomalía lipídica primaria es colesterol HDL bajo.

La lecitina-colesterol aciltransferasa (LCAT) es una enzima que cataliza la esterificación de colesterol libre mediante la transferencia de un grupo acilo de la fosfatidilcolina sobre el grupo 3-hidroxilo del colesterol, formando éster de colesterilo y lisofosfatidilcolina. McLean et al. (1986) Proc. Natl. Acad Sci. 83: 2335 y McLean et al. (1986) Nucleic Acids Res. 14 (23) : 9397. Se sintetiza LCAT en el hígado y se secreta al plasma, donde se combina con HDL, denominadas lipoproteínas antiaterogénicas. Estas partículas de HDL tienen la capacidad de aceptar el colesterol en exceso, que entonces se esterifica mediante LCAT en las partículas de HDL. Las moléculas de éster de colesterilo en las partículas de HDL o bien se transportan al hígado directamente a través del receptor SR-BI, o bien se transfieren a lipoproteínas que contienen apoB, incluyendo lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) y LDL, mediada por CETP, y entonces se transportan al hígado a través de la ruta del receptor de LDL. Este mecanismo, denominado transporte de colesterol inverso (Glomset (1968) J. Lipid Res. 9:155) , permite la eliminación del colesterol en exceso del cuerpo, y por tanto está implicado en la prevención de la aterogénesis. LCAT desempeña un papel clave en este proceso creando un gradiente de colesterol libre entre las membranas plasmáticas y las lipoproteínas circulantes.

Wang et al. (2000) . Biochim. Biophys. Acta 1488 (3) , 268-277 tratan la importancia de los grupos sulfhidrilo libres de LCAT para determinar su sensibilidad a la inactivación oxidativa.

Esta invención proporciona proteínas LCAT modificadas con estabilidad y/o actividad enzimática aumentada y métodos para el tratamiento de cardiopatía coronaria, aterosclerosis, trastornos inflamatorios y trastornos asociados con trombosis usando estas proteínas LCAT modificadas.

Sumario de la invención La invención se refiere a:

1. Una proteína lecitina-colesterol aciltransferasa (LCAT) modificada, en la que la proteína LCAT modificada comprende una modificación en la secuencia de aminoácidos de LCAT madura expuesta en SEQ ID NO: 1; o SEQ ID NO: 2 tal como se expone en la figura 2; y

la modificación consiste en una sustitución en el residuo de aminoácido C31 seleccionada del grupo que consiste en C31I, C31M, C31F, C31V, C31W, C31Y, C31R y C31H.

2. Una proteína lecitina-colesterol aciltransferasa (LCAT) modificada, en la que la proteína LCAT modificada comprende una modificación en la secuencia de aminoácidos de LCAT madura expuesta en SEQ ID NO: 1; o SEQ ID NO: 2 tal como se expone en la figura 2; y

la modificación consiste en una sustitución en el residuo de aminoácido C31 seleccionada del grupo que consiste en C31I, C31M, C31F, C31V, C31W, C31Y, C31R y C31H, y una sustitución adicional en una posición de residuo de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en F1, L4, N5, V28, P29, G30, L32, G33 y N34.

3. La proteína LCAT modificada de 2, en la que la sustitución adicional se selecciona del grupo que consiste en F1A, L4F, N5E, N5Q, N5D, N5A, V28A, V28I, V28C, V28T, V28R, P29G, P29F, P29T, G30A, G30I, L32A, L32I, L32M, L32F, L32C, L32W, L32Y, L32T, L32S, L32N, L32H, L32E, G33I, G33M, G33F, G33S, G33H, N34A, N34C, N34S y N34R.

4. La proteína LCAT modificada de 2, en la que la sustitución C31 es una sustitución C31Y y la sustitución adicional es en una posición de residuo de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en F1, L4, N5, L32 y N34.

5. La proteína LCAT modificada de 4, en la que la sustitución adicional se selecciona del grupo que consiste en F1S, F1W, L4F, L4M, N5D, L4K, N34S, L32F y L32H.

6. La proteína LCAT modificada de 5, que comprende una sustitución L4F y una sustitución C31Y.

7. La proteína LCAT modificada de 5, que comprende una sustitución C31Y, en la que la sustitución adicional es una sustitución N5D.

8. La proteína LCAT modificada de 4, que comprende una sustitución N5 y una sustitución C31Y.

9. La proteína LCAT modificada de 4, que comprende una sustitución L4 y una sustitución C31Y.

10. La proteína LCAT modificada de uno cualquiera de 1-9, que tiene una actividad enzimática mayor que la proteína LCAT silvestre expuesta en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 tal como se determina en un ensayo de tasa de esterificación de colesterol (CER) de la actividad de LCAT plasmática.

11. Una proteína LCAT modificada que comprende la proteína LCAT de cualquiera de 1-10 y un vehículo.

12. La proteína LCAT modificada de 11, en la que el vehículo se selecciona del grupo que consiste en una región constante de inmunoglobulina (Fc) , un polímero soluble en agua y polietilenglicol.

13. Una composición farmacéutica que comprende una proteína LCAT modificada de uno cualquiera de 1-12 y un portador farmacéuticamente aceptable.

14. Una proteína LCAT modificada de uno cualquiera de 1-12 para su uso en terapia.

15. Una proteína LCAT... [Seguir leyendo]

1. Proteína lecitina-colesterol aciltransferasa (LCAT) modificada, en la que la proteína LCAT modificada comprende una modificación en la secuencia de aminoácidos de LCAT madura expuesta en SEQ ID NO: 1; o SEQ ID NO: 2 tal como se expone en la figura 2; y

la modificación consiste en una sustitución en el residuo de aminoácido C31 seleccionada del grupo que consiste en C31I, C31M, C31F, C31V, C31W, C31Y, C31R y C31H.

2. Proteína lecitina-colesterol aciltransferasa (LCAT) modificada, en la que la proteína LCAT modificada comprende una modificación en la secuencia de aminoácidos de LCAT madura expuesta en SEQ ID NO: 1; o SEQ ID NO: 2 tal como se expone en la figura 2; y

la modificación consiste en una sustitución en el residuo de aminoácido C31 seleccionada del grupo que consiste en C31I, C31M, C31F, C31V, C31W, C31Y, C31R y C31H, y una sustitución adicional en una posición de residuo de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en F1, L4, N5, V28, P29, G30, L32, G33 y N34.

3. Proteína LCAT modificada según la reivindicación 2, en la que la sustitución adicional se selecciona del grupo que consiste en F1A, L4F, N5E, N5Q, N5D, N5A, V28A, V28I, V28C, V28T, V28R, P29G, P29F, P29T, G30A, G30I, L32A, L32I, L32M, L32F, L32C, L32W, L32Y, L32T, L32S, L32N, L32H, L32E, G33I, G33M, G33F, G33S, G33H, N34A, N34C, N34S y N34R.

4. Proteína LCAT modificada según la reivindicación 2, en la que la sustitución C31 es una sustitución C31Y y la sustitución adicional es en una posición de residuo de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en F1, L4, L32 y N34.

5. Proteína LCAT modificada según la reivindicación 4, en la que la sustitución adicional se selecciona del grupo que consiste en F1S, F1W, L4F, L4M, N5D, L4K, N34S, L32F y L32H.

6. Proteína LCAT modificada según la reivindicación 5, que comprende una sustitución L4F y una sustitución C31Y.

7. Proteína LCAT modificada según la reivindicación 5, que comprende una sustitución C31Y, en la que la sustitución adicional es una sustitución N5D.

8. Proteína LCAT modificada según la reivindicación 4, que comprende una sustitución N5 y una sustitución C31Y.

9. Proteína LCAT modificada según la reivindicación 4, que comprende una sustitución L4 y una sustitución C31Y.

10. Proteína LCAT modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, que tiene una actividad enzimática mayor que la proteína LCAT silvestre expuesta en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 tal como se determina en un ensayo de tasa de esterificación de colesterol (CER) de la actividad de LCAT plasmática.

11. Proteína LCAT modificada que comprende la proteína LCAT según cualquiera de las reivindicaciones 1-10 y un vehículo.

12. Proteína LCAT modificada según la reivindicación 11, en la que el vehículo se selecciona del grupo que consiste en una región constante de inmunoglobulina (Fc) , un polímero soluble en agua y polietilenglicol.

13. Composición farmacéutica que comprende una proteína LCAT modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-12 y un portador farmacéuticamente aceptable.

14. Proteína LCAT modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, para su uso en terapia.

15. Proteína LCAT modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, para su uso en un método de tratamiento de un trastorno relacionado con LCAT.

16. Proteína LCAT modificada según la reivindicación 15, para su uso en un método de tratamiento de un trastorno relacionado con LCAT, en la que el trastorno relacionado con LCAT se selecciona del grupo que consiste en aterosclerosis, inflamación, trombosis, cardiopatía coronaria, tensión arterial alta, síndrome de deficiencia de LCAT, enfermedad de Alzheimer, opacidad corneal, síndrome metabólico, dislipidemia, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, isquemia crítica de extremidades y angina de pecho.

17. Proteína LCAT modificada según la reivindicación 15, en la que la terapia es para aumentar el colesterol HDL, o prevenir la acumulación de colesterol.

18. Proteína LCAT modificada según la reivindicación 15, para su uso en un método de tratamiento o prevención de una enfermedad cardiovascular.

19. Proteína LCAT modificada según la reivindicación 15, para su uso en el tratamiento o la prevención de aterosclerosis.

20. Proteína LCAT modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 15-19, en la que la proteína LCAT se administra en combinación con un agente adicional.

21. Proteína LCAT modificada según la reivindicación 20, en la que el agente adicional se selecciona del grupo que consiste en una citocina, un fármaco contra la aterosclerosis, un fármaco hipocolesterolemiante, un inhibidor de ACE, un fármaco antiinflamatorio y un fármaco antitrombosis y un fármaco antidiabético.

AAB86630 lecitina colesterol acil transferasa [Canis familiaris]