Dispositivo microfluídico y procedimientos de utilización del mismo.

Un dispositivo microfluídico (200), que comprende componentes elastoméricos,

y que tiene un canal de flujo (204, 702), en el que dicho canal de flujo tiene una pluralidad de canales de flujo ciego (206) que se abren hacia el interior y están en comunicación de fluidos con el canal de flujo, caracterizándose cada canal de flujo ciego por tener una parte de apertura, una parte de canal, y una parte final, y en el que una región del final de cada canal de flujo ciego define un sitio de reacción (208, 706),

en el que cada canal de flujo ciego está asociado con una válvula (212) que cuando se cierra aísla el sitio de reacción del canal de flujo, y caracterizado por que las válvulas asociadas con cada una de la pluralidad de canales de flujo ciego en comunicación de fluidos con el canal de flujo están bajo el control de un canal de control común (210, 712) y se cierran o abren de forma coordinada.

Dispositivo microfluídico y procedimientos de utilización del mismo

Referencia cruzada a las solicitudes relacionadas Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos Nº 60/391.529, presentada el 24 de junio de 2002, y de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos Nº 60/335.292, presentada el 30 de noviembre de 2001.

Antecedente Recientemente, se han coordinado esfuerzos para desarrollar y fabricar sistemas microfluídicos para llevar a cabo diversos análisis y síntesis químicos y bioquímicos, tanto en aplicaciones preparativas como analíticas. El fin de preparar dichos dispositivos surge debido a los beneficios significativos que se pueden obtener de la miniaturización con respecto a los análisis y las síntesis llevados a cabo en macroescala. Tales beneficios incluyen una sustancial reducción en el tiempo, coste y en los requisitos de espacio de los dispositivos utilizados para llevar a cabo el análisis o la síntesis. Adicionalmente, los dispositivos microfluídicos tienen el potencial de adaptarse para el uso con sistemas automatizados, proporcionando de esta forma beneficios de reducciones adicionales de costes y la disminución de los errores de los operarios, gracias a una reducción en la implicación humana. Se han propuesto dispositivos microfluídicos para uso en una variedad de aplicaciones, incluyendo, por ejemplo, electroforesis capilar, cromatografía de gases y separaciones celulares.

Sin embargo, se ha frustrado a menudo la obtención de estos beneficios debido a diversas complicaciones asociadas con los dispositivos microfluídicos que se han fabricado. Por ejemplo, muchos de los dispositivos microfluídicos actuales se han fabricado a partir de sustratos basados en sílice; estos materiales son difíciles y complicados de maquinar y los dispositivos preparados a partir de dichos materiales son frágiles. Además, el transporte de fluido a través de muchos dispositivos microfluídicos existentes requiere la regulación de complicados campos eléctricos para transportar los fluidos de una manera controlada a través del dispositivo.

De esta manera, a la vista de los anteriores beneficios que se pueden conseguir con los dispositivos microfluídicos, pero con las actuales limitaciones de los dispositivos existentes, sigue existiendo necesidad de dispositivos microfluídicos diseñados para utilizar en la realización de una variedad de análisis químicos y bioquímicos. Debido a su importancia en la moderna bioquímica, existe una particular necesidad de dispositivos que se puedan utilizar para llevar a cabo reacciones de amplificación de ácidos nucleicos, teniendo a la vez suficiente versatilidad para el uso también en otros tipos de análisis.

Los dispositivos con la capacidad para llevar a cabo amplificaciones de ácido nucleico podrían tener diversas utilidades. Por ejemplo, dichos dispositivos podrían usarse como herramienta analítica para determinar si un ácido nucleico diana concreto de interés está presente o ausente en una muestra. De esta manera, los dispositivos podrían utilizarse para analizar la presencia de patógenos concretos (por ejemplo, virus, bacterias u hongos) , y con fines de identificación (por ejemplo, paternidad y aplicaciones forenses) . Dichos dispositivos podrían utilizarse para detectar o caracterizar ácidos nucleicos específicos que se ha demostrado anteriormente que están correlacionados con enfermedades o trastornos genéticos concretos. Cuando se usan como herramientas analíticas, los dispositivos podrían también utilizarse para llevar a cabo los análisis de genotipación y los análisis de expresión génica (por ejemplo, los análisis de expresión génica diferenciales) . De forma alternativa, los dispositivos pueden utilizarse de una manera preparativa para amplificar suficiente ácido nucleico para el análisis adicional de dicha secuenciación del producto amplificado, la tipificación celular, la huella genética del ADN y similares. Se pueden utilizar productos amplificados en diversas aplicaciones de ingeniería genética, tales como la inserción en un vector que se puede utilizar a continuación para transformar células para la producción de un producto de proteína deseado

Resumen Se proporciona en la presente memoria una variedad de dispositivos y procedimientos para llevar a cabo análisis microfluídicos, incluyendo dispositivos que se pueden utilizar para llevar a cabo reacciones de ciclación térmica tales como reacciones de amplificación de ácidos nucleicos. Los dispositivos difieren de los dispositivos microfluídicos convencionales en que incluyen componentes elastoméricos, en algunos ejemplos, mucho o todo el dispositivo está compuesto por material elastomérico.

Determinados dispositivos están diseñados para llevar a cabo reacciones de ciclación térmica (por ejemplo, la PCR) con dispositivos que incluyen una o más válvulas elastoméricas para regular el flujo de disolución a través del dispositivo. De esta manera, se proporcionan también procedimientos para llevar a cabo las reacciones de amplificación con dispositivos de este diseño.

Los dispositivos incluyen canales de flujo ciego que incluyen una región que funciona como un sitio de reacción. Algunos de esos dispositivos incluyen un canal de flujo formado en el interior de un material elastomérico, y una pluralidad de canales de flujo ciego en comunicación de fluidos con el canal de flujo, con una región de cada canal de flujo ciego definiendo un sitio de reacción. Los dispositivos pueden incluir también uno o más canales de control que se solapan e intersectan cada uno de los canales de flujo ciego, en los que una membrana elastomérica separa en cada intersección el uno o más canales de control de los canales de flujo ciego. La membrana elastomérica de dichos dispositivos está dispuesta para desviarse en o retirarse del canal de flujo ciego en respuesta a una fuerza de actuación. Los dispositivos pueden incluir adicionalmente de forma opcional una pluralidad de canales de protección formados en el interior del material elastomérico y que solapan el canal de flujo y/o uno o más de los sitios de reacción. Los canales de protección están diseñados para tener flujo de fluidos a su través para reducir la evaporación procedente de los canales de flujo y de los sitios de reacción del dispositivo. Adicionalmente, los dispositivos pueden incluir opcionalmente uno o más reactivos depositados en el interior de cada uno de los sitios de reacción.

En determinados dispositivos, el canal de flujo es uno de una pluralidad de canales de flujo, cada uno de los canales de flujo está en comunicación de fluidos con múltiples canales de flujo ciego con ramificaciones procedentes de los anteriores. En los dispositivos de este diseño, en algunos ejemplos, la pluralidad de canales de flujo están interconectados entre sí de tal manera que se puede introducir el fluido en cada uno de los sitios de reacción mediante una única entrada. En otros dispositivos, sin embargo, la pluralidad de canales de flujo están aislados entre sí de tal manera que el fluido introducido en un canal de flujo no puede fluir a otro canal de flujo, y cada canal de flujo comprende una entrada en uno o ambos extremos en los que se puede introducir el fluido.

Otro dispositivo de acuerdo con la presente invención incluye una matriz de sitios de reacción que tiene una densidad de al menos 50 sitios/cm2, formándose normalmente los sitios de reacción en el interior de un material elastomérico. Otros dispositivos pueden tener mayores densidades tales como, por ejemplo, de al menos 250.000 o 1000 sitios/cm2.

Otro dispositivo adicional de acuerdo con la presente invención incluye un sitio de reacción formado en el interior de un sustrato elastomérico, en el cual el reactivo para llevar a cabo una reacción queda inmovilizado de forma covalente. El reactivo puede ser uno o más reactivos para llevar a cabo esencialmente cualquier tipo de reacción. El reactivo en algunos dispositivos incluye reactivos para llevar a cabo una reacción de amplificación del ácido nucleico. De esta manera, en algunos dispositivos, el reactivo comprende un cebador, una polimerasa y uno o más nucleótidos. En otros dispositivos, el reactivo es un molde de ácido nucleico.

Los anteriores dispositivos se pueden utilizar para llevar a cabo numerosos tipos diferentes de reacciones, que incluyen aquellas que implican una regulación de la temperatura, por ejemplo, análisis de termociclación de ácidos nucleicos) . Los procedimientos llevados a cabo con determinados dispositivos de tipo canal ciego implican proporcionar un dispositivo microfluídico que comprende un canal de flujo formado en el interior de un material elastomérico; y una pluralidad... [Seguir leyendo]

1. Un dispositivo microfluídico (200) , que comprende componentes elastoméricos, y que tiene un canal de flujo (204, 702) , en el que dicho canal de flujo tiene una pluralidad de canales de flujo ciego (206) que se abren hacia el interior y están en comunicación de fluidos con el canal de flujo, caracterizándose cada canal de flujo ciego por tener una parte de apertura, una parte de canal, y una parte final, y en el que una región del final de cada canal de flujo ciego define un sitio de reacción (208, 706) , en el que cada canal de flujo ciego está asociado con una válvula (212) que cuando se cierra aísla el sitio de reacción del canal de flujo, y caracterizado por que las válvulas asociadas con cada una de la pluralidad de canales de flujo ciego en comunicación de fluidos con el canal de flujo están bajo el control de un canal de control común (210, 712) y se cierran o abren de forma coordinada.

2. Un dispositivo microfluídico de la reivindicación 1, en el que el canal de control solapa e intersecta cada canal de flujo ciego (204) , en el que la válvula (212) separa el canal de control del canal de flujo ciego en cada intersección, y en el que dicha válvula comprende un material elastomérico dispuesto para desviarse en o retirarse del canal de flujo ciego en respuesta a una fuerza de acción.

3. Un dispositivo microfluídico de cualquier reivindicación anterior, en el que el canal de flujo (204) es uno de una pluralidad de canales de flujo (304, 404, 702) , cada canal de flujo por separado está en comunicación de fluidos con una pluralidad de canales de flujo ciego que se derivan de los anteriores, en el que las válvulas asociadas con un canal de flujo individual están bajo el control de un canal de control común (310, 410, 712) y se cierra o abre de forma coordinada.

4. El dispositivo microfluídico de la reivindicación 3 en el que la pluralidad de canales de flujo está dispuesta de tal manera que los canales de flujo son sustancialmente paralelos entre sí.

5. Un dispositivo microfluídico de la reivindicación 3, en el que la pluralidad de canales de flujo (304) está interconectada entre sí de tal manera que se puede introducir fluido en cada uno de los sitios de reacción mediante una única entrada (314) .

6. Un dispositivo microfluídico de la reivindicación 5, en el que:

la pluralidad de canales de flujo comprende.

(i) una pluralidad de canales de flujo vertical;

(ii) una pluralidad de canales de flujo horizontal, estando un extremo de cada canal de flujo horizontal en comunicación de fluidos con uno de los canales de flujo vertical y estando el otro extremo de cada canal de flujo horizontal en comunicación de fluidos con otro de los canales de flujo vertical, en el que el fluido puede fluir desde un canal de flujo horizontal a otro canal de flujo horizontal mediante los canales de flujo vertical. los canales de flujo de derivatización son sustancialmente perpendiculares a los canales de flujo horizontal.

7. Un dispositivo microfluídico de la reivindicación 5, en el que los canales de flujo ciego (306) que se derivan de los canales de flujo adyacentes (304) están intercalados entre sí.

8. Un dispositivo microfluídico de la reivindicación 3, en el que la pluralidad de canales de flujo (404) están aislados entre sí de tal manera que el fluido introducido en un canal de flujo no puede fluir a otro canal de flujo, y cada canal de flujo comprende una única entrada (414) en un extremo en el que se puede introducir el fluido.

9. Un dispositivo microfluídico de la reivindicación 3, en el que cada uno de una pluralidad de canales de flujo tiene dos extremos, la pluralidad de canales de flujo están aislados entre sí de tal manera que el fluido introducido en un canal de flujo no puede fluir a otro canal de flujo, y cada canal de flujo comprende una entrada localizada en cada extremo.

10. Un dispositivo microfluídico de cualquier reivindicación anterior que comprende además una pluralidad de canales de protección (716) formados en el interior del material elastomérico y que solapa uno o más de los canales de flujo o ramificación y/o uno o más de los sitios de reacción

11. Un dispositivo microfluídico de cualquier reivindicación anterior, que comprende además uno o más reactivos depositados en el interior de cada uno de los sitios de reacción, en el que opcionalmente, el reactivo o reactivos se depositan de forma no covalente.

12. Un dispositivo microfluídico de cualquier reivindicación anterior que comprende una matriz de sitios de reacción que tiene una densidad de al menos 50 sitios/cm2.

13. Un dispositivo microfluídico de la reivindicación 12, en el que la matriz de sitios de reacción se forma en el interior de un material elastomérico.

14. Un dispositivo microfluídico de la reivindicación 12 o la reivindicación 13, en el que la densidad es al menos de 250 sitios/cm2, preferiblemente al menos 500 sitios/cm2, por ejemplo, al menos 1000 sitios/cm2.

15. Un dispositivo microfluídico de acuerdo con cualquier reivindicación anterior en el que cada sitio de reacción está formado en el interior de un sustrato elastomérico y comprende un reactivo para llevar a cabo depositado de forma no covalente en el anterior.

16. Un dispositivo microfluídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 en el que cada sitio de reacción está formado en el interior de un sustrato elastomérico y comprende un reactivo para llevar a cabo una reacción depositado de forma covalente en el anterior.

17. un dispositivo microfluídico de la reivindicación 16, en el que el reactivo está unido al sustrato mediante un enlazador, en el que opcionalmente, el enlazador es:

(i) un enlazador fotolábil; o

(ii) un enlazador termolábil.

18. Un dispositivo microfluídico de la reivindicación 15, en el que el reactivo comprende uno o más reactivos para llevar a cabo una reacción de amplificación del ácido nucleico, en el que opcionalmente, el reactivo comprende:

(i) un cebador, polimerasa y/o uno o más nucleótidos, o

(ii) un molde de ácido nucleico.

19. Un dispositivo microfluídico de cualquier reivindicación anterior en el que el material elastomérico tiene un módulo de Young en el intervalo de 20 Pa a 1 GPa.

20. Un procedimiento para llevar a cabo un análisis, que comprende:

(a) proporcionar un dispositivo microfluídico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19;

(b) introducir una disolución en cada uno de los sitios de reacción, en el que la disolución comprende al menos un reactivo;

(c) aislar los sitios de reacción cerrando dichas válvulas asociadas con los sitios de reacción;

(d) detectar una reacción en uno o más de los sitios de reacción aislados.

21. Un procedimiento de la reivindicación 20, que comprende además calentar el al menos un reactivo en el interior de los sitios de reacción.

22. Un procedimiento de la reivindicación 20 o la reivindicación 21, en el que el al menos un reactivo comprende una mezcla de reacción, en el que opcionalmente la mezcla de reacción comprende:

(i) los componentes de una reacción de amplificación del ácido nucleico; o

(ii) los componentes de un ensayo de actividad de la enzima.

23. Un procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, en el que el al menos un reactivo se mezcla con un reactivo depositado en cada uno de los sitios de reacción para formar una mezcla de reacción, en el que el opcionalmente el al menos un reactivo comprende.

(i) un molde de ácido nucleico y el reactivo depositado comprenden uno o más componente de una reacción de amplificación del ácido nucleico, o

(ii) uno o más componentes de una reacción de amplificación del ácido nucleico y del reactivo depositado comprenden un molde de ácido nucleico.

24. Un procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23:

en el que el canal de flujo es uno de una pluralidad de canales de flujo, estando cada uno en comunicación de fluidos con múltiples canales de flujo ciego; y en el que la pluralidad de canales de flujo están interconectados con otro de tal manera que se puede introducir el fluido en cada uno de los sitios de reacción mediante una única entrada, el al menos un reactivo se introduce mediante una única entrada.

25. Un procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24, en el que existen al menos 100 sitios de reacción, en el que opcionalmente existen al menos 1.000 sitios de reacción, preferiblemente al menos 10.000 sitios de reacción, por ejemplo, al menos 100.000 sitios de reacción.

26. Un procedimiento de la reivindicación 24 o la reivindicación 25, en el que un primer agente se introduce mediante la única entrada en cada uno de los sitios de reacción y se deposita un segundo reactivo en cada uno de los sitios de reacción, diferentes sitios de reacción que tienen diferentes segundos reactivos, dando como resultado por tanto una reacción diferente que implica el primer reactivo en cada uno de los diferentes sitios de reacción, en el que opcionalmente, los diferentes segundos reactivos comprenden diferentes cebadores de ácido nucleico y el al menos un reactivo comprende un molde de ácido nucleico.

27. Un procedimiento de la reivindicación 20, en el que:

el al menos un canal de flujo es uno de una pluralidad de canales de flujo, estando cada uno de los canales de flujo en comunicación de fluidos con uno o más de los canales de flujo ciego; la pluralidad de canales de flujo están aislados entre sí de tal manera que el fluido introducido en un canal de flujo no puede fluir a otro canal de flujo; y la introducción comprende introducir por separado el al menos un reactivo en cada uno de la pluralidad de canales de flujo.

28. Un procedimiento de la reivindicación 27, en el que:

se introduce un primer reactivo en cada canal de flujo; los sitios de reacción en comunicación de fluidos con cada canal de flujo contienen un segundo reactivo, difiriendo los segundos reactivo entre los sitios de reacción en comunicación de fluidos con los diferentes canales de flujo; la introducción comprende introducir el primer reactivo en cada uno de los canales de flujo, en el que opcionalmente los diferentes segundos reactivos comprenden diferentes cebadores de ácido nucleico y el primer reactivo comprende un molde de ácido nucleico.

29. Un procedimiento de la reivindicación 20 en el que:

los sitios de reacción del dispositivo microfluídico de la etapa (a) comprenden un primer reactivo para llevar a cabo un análisis, y dicho primer reactivo se deposita de forma no covalente sobre un sustrato elastomérico; el primer reactivo y el reactivo en disolución se mezclan para formar una mezcla de reacción tras la introducción de disolución de acuerdo con la etapa (b) , y la reacción detectada está entre el primer reactivo y el reactivo de la disolución.

30. Un procedimiento de la reivindicación 29, que comprende además calentar la mezcla de reacción.

31. Un procedimiento de la reivindicación 29 o la reivindicación 30, en el que la introducción del segundo reactivo da lugar a la suspensión del primer reactivo en el sitio de reacción.

32. Un procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 29 a 31, en el que el uno o más sitios de reacción es una matriz de sitios de reacción.

33. Un procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32, en el que el análisis es un análisis de ácido nucleico, el primer reactivo es un reactivo que interactúa con un ácido nucleico y el segundo reactivo es un ácido nucleico de prueba, en el que opcionalmente el análisis es una reacción de amplificación del ácido nucleico, el primer reactivo comprende uno o más reactivos para llevar a cabo la reacción de amplificación del ácido nucleico y el segundo reactivo es un molde de ácido nucleico.

34. Un procedimiento de la reivindicación 33, en el que:

los sitios de reacción son una matriz de sitios de reacción; diferentes reactivos de amplificación del ácido nucleico están presente en diferentes sitios de reacción; y se introduce el mismo molde de ácido nucleico en cada uno de los sitios de reacción.

35. Un procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 22, 23, 33 y 34 en el que el procedimiento comprende además someter a termociclación la mezcla de reacción.

36. Un procedimiento de la reivindicación 29, en el que el análisis es un análisis de proteínas, el primer reactivo es un potencial ligando de proteínas, y el segundo reactivo es una proteína de prueba, en el que opcionalmente, el potencial ligando de proteínas se selecciona entre el grupo que consiste en una proteína, un anticuerpo, un sustrato de enzima, un cofactor enzimático, y un inhibidor enzimático.

37. Un procedimiento de la reivindicación 29, en el que el análisis es un análisis celular, el primer reactivo es un reactivo que reacciona potencialmente con la célula, y el segundo reactivo es una célula de ensayo.

38. Un procedimiento de la reivindicación 33 en el que el primer reactivo comprende además uno o más aditivos seleccionados entre el grupo que consiste en gelatina, glicerol y un detergente.

39. Un procedimiento de la reivindicación 20 en el que dicho dispositivo microfluídico comprende una matriz de sitios de reacción formada en el interior de un sustrato y que tiene una densidad de al menos 50 sitios/cm2.

40. Un procedimiento de la reivindicación 39, en el que la matriz tiene una densidad de al menos 250 sitios/cm2, preferiblemente en el que la matriz tiene una densidad de al menos 500 sitios/cm2, por ejemplo, de al menos 1000 sitios/cm2.

41. Un procedimiento de la reivindicación 20 en el que dicho dispositivo microfluídico comprende al menos un sitio de reacción que está formado en el interior de un sustrato elastomérico y una pluralidad de canales de protección formados también en el interior del sustrato elastomérico y en el que dicho procedimiento comprende:

(c) (i) calentar el al menos un reactivo en el interior de al menos uno de los sitios de reacción; y

(c) (ii) hacer fluir un fluido a través de los canales de protección antes o durante el calentamiento para reducir la evaporación procedente del al menos un sitio de reacción.

42. Un procedimiento de la reivindicación 41, en el que:

la introducción comprende introducir un molde de ácido nucleico en el al menos un sitio de reacción, a la vez que el molde de ácido nucleico se mezcla con uno o más reactivos de amplificación del ácido nucleico en el al menos un sitio de reacción el calentamiento comprende someter a termociclación el molde de ácido nucleico y los reactivos de amplificación para formar un producto amplificado; la detección comprende detectar el producto amplificado.

43. Un procedimiento de la reivindicación 41 o la reivindicación 42, en el que:

(i) el fluido es una disolución acuosa; o

(ii) el fluido es un compuesto hidrófobo, opcionalmente un aceite.

44. Un dispositivo microfluídico de las reivindicaciones 1 a 18 que comprende:

(a) una cavidad que es parte de una red microfluídica formada en un sustrato elastomérico; y

(b) una pluralidad de canales de protección que solapan la cavidad y se separan de la cavidad mediante una membrana elastomérica, en el que cada canal de protección está dimensionado (i) para permitir a la disolución fluir a su través, y (ii) de tal manera que no existe una reducción sustancial en el flujo de la disolución dentro, fuera o a través de la cavidad debido a la desviación de la (s) membrana (s) tras la aplicación de una fuerza de acción a los canales de protección.

45. Un dispositivo microfluídico de la reivindicación 44, en el que la cavidad es:

(i) un canal de flujo; o

(ii) una cámara de reacción

46. Un dispositivo microfluídico de la reivindicación 44 o la reivindicación 45 en el que los canales de protección tienen un área de la sección transversal de menos de 50.000 µm2, en el que opcionalmente el área de la sección transversal es menor de 10.000 µm2, preferiblemente menor de 1.000 µm2, por ejemplo, menor de 100 µm2.

47. un dispositivo microfluídico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, que comprende:

(a) un sistema microfluídico que comprende uno o más canales de flujo y/o uno o más sitios de reacción; y

(b) una pluralidad de canales de protección que solapas el sistema microfluídico y se separan del anterior mediante un elastómero, en el que la separación borde a borde entre los canales de protección es de entre 1 µm y 1 mm.

48. Un dispositivo microfluídico de la reivindicación 47, en el que la separación es de entre 5 µm y 500 µm, en el que opcionalmente la separación es de entre 10 µm y 100 µm, preferiblemente entre 40 µm y 75 µm.

49. Un dispositivo microfluídico de la reivindicación 18 en el que el reactivo comprende además uno o más aditivos seleccionados entre el grupo seleccionado entre gelatina, glicerol y un detergente.