Método para determinar mutaciones de resistencia a fármacos en cualquiera de las regiones de proteína no estructural NS3 a NS5B del virus de la hepatitis C (HCV) para los genotipos 1 a 6.

Métodos para determinar mutaciones resistencia a fármacos en cualquiera de las regiones de proteína no estructural NS3 a NS5B del virus de la Hepatitis C

(HCV) para los genotipos 1 a 6, más en particular para los genotipos específicos de subtipo 1a, 1b, 2a, 2b, 3a, 4a y 4d, presentes en una muestra que comprende:

a) obtener dicha muestra de un paciente,

b) extraer material genético viral de dicha muestra,

c) amplificar la región NS5B de HCV para generar un amplicón de ADN de 388 pares de bases usando cebadores que tienen secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEC ID Nº 1-5,

d) secuenciar el amplicón para obtener una secuencia de 329 pares de bases usando las secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEC ID Nº 3-5,

e) realizar análisis de árboles filogenéticos usando la información de secuencia de 329 pares de bases de NS5B para obtener información de subtipo de HCV en dicha muestra del paciente,

f 1) usar cebadores específicos de subtipo que tienen las secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEC ID Nº 6-9, 42-45, 104-107, 120-123, 145-148 o 180-183 para la generación de un amplicón de ADN que comprende la proteína no estructural NS3 (181 aminoácidos N-terminales),

g 1) secuencia el amplicón de NS3 para obtener una secuencia de 543 pares de bases usando las secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEC ID Nº 8 y 9; 43 y 45-46; 104 y 106; 120 y 122; 146 y 148 o 180 y 182

o

f2) usar cebadores específicos de subtipo que tienen las secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEC ID Nº 13-16, 54 y 59-66, 124-133, 158 y 160-168 o 194-197 para la generación de un amplicón de ADN que comprende la polimerasa NS5B, g 2) secuenciar el amplicón de la polimerasa NS5B para obtener una secuencia de 1776 pares de bases usando las secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEC ID Nº 15-16 y 87-92; 54, 59 y 61-66; 124 y 127-133; 158-159, 161 y 163-168 o 197-204

o

f 3) usar cebadores específicos de subtipo que tienen las secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEC ID Nº 30-33, 67-70, 93-96, 108-111, 134-137 o 169-172 para la generación de un amplicón de ADN que comprende NS3/4A,

g 3) secuenciar el amplicón de la proteasa NS3/4A para obtener una secuencia de 2055 pares de bases usando las secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEC ID Nº 34-41; 68 y 71-77; 95 y 97-103; 112- 119; 136 y 138-144 o 171 y 173-179

o

f4) usar cebadores específicos de subtipo que tienen las secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEC ID Nº 47-50, 78-81,149-151 y 159 o 184-187 para la generación de un amplicón de ADN que comprende NS4B/5A,

g 4) secuenciar el amplicón de NS4B y NS5A para obtener una secuencia de los dos genes NS4B y NS5A usando las secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEC ID Nº 51-57; 79 y 81-87; 152-159 o 185 y 187-193;

h) alinear la secuencia obtenida en la etapa (g1), (g2), (g3) o (g4) con una secuencia de HCV de referencia o de tipo silvestre,

i) determinar una o más mutaciones de resistencia a fármacos en el material genético viral presente en la muestra del paciente.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2009/062986.

Solicitante: Janssen Diagnostics BVBA.

Nacionalidad solicitante: Bélgica.

Dirección: TURNHOUTSEWEG 30 2340 BEERSE BELGICA.

Inventor/es: STUYVER,LIEVEN JOZEF, KOLETZKI,DIANA, BERKE,JAN MARTIN, VANDENBROUCKE,INA ISABEL, VIJGEN,LEEN ROGER.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/68 (en los que intervienen ácidos nucleicos)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas;... > C07K14/18 (Togaviridae, p. ej. Flavivirus, virus de la peste, virus de la fiebre amarilla, virus de la hepatitis C, virus de la encefalitis japonesa)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/70 (en los que intervienen virus o bacteriófagos)

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Fragmento de la descripción:

Método para determinar mutaciones de resistencia a fármacos en cualquiera de las regiones de proteína no estructural NS3 a NS5B del virus de la hepatitis C (HCV) para los genotipos 1 a 6

La presente invención se refiere a un método para determinar mutaciones de resistencia a fármacos en cualquiera de las regiones de proteína no estructural NS3 a NS5B del virus de la hepatitis C (HCV) para los genotipos 1 a 6, más en particular para los genotipos específicos de subtipo 1a, 1b, 2a, 2b, 3a, 4a y 4d.

El HCV es un virus de ARN de cadena positiva monocatenario, con un genoma de aproximadamente 9.6 bases que pertenece a la familia Flaviviridae de virus del género hepacivirus. La región NS5B del poligen de ARN codifica un ARN de 65 kDa dependiente de ARN polimerasa (RdRp), que es esencial para la replicación viral. Después de la infección aguda inicial, la mayoría de los individuos infectados desarrolla hepatitis crónica porque HCV se replica preferentemente en hepatocitos pero no es directamente citopático. En particular, la ausencia de una respuesta vigorosa de linfocitos T y la alta propensión del virus a mutar parecen promover una alta tasa de infección crónica. La hepatitis crónica puede progresar hasta fibrosis hepática, conduciendo a cirrosis, enfermedad hepática de fase final, y HCC (carcinoma hepatocelular), haciendo que sea la causa principal de trasplantes de hígado.

La transmisión de HCV puede suceder a través de contacto con sangre o productos sanguíneos contaminados, por ejemplo después de transfusión sanguínea o uso de fármacos intravenosos. La introducción de ensayos de diagnóstico usados en exploración de sangre ha conducido a una tendencia descendente en la incidencia de HCV post-transfusión. Sin embargo, dada la lenta progresión hasta la enfermedad hepática de fase final, las infecciones existentes continuarán presentando una carga médica y económica importante durante décadas.

Existen seis genotipos principales de HCV y más de 5 subtipos, que están distribuidos geográficamente de forma diferente. El HCV de genotipo 1 es el genotipo predominante en Europa y los Estados Unidos. La extensiva heterogeneidad genética de HCV tiene implicaciones clínicas y de diagnóstico importantes, que quizá explican las dificultades en el desarrollo de vacunas y la ausencia de respuesta a las terapias actuales.

La variabilidad genética de HCV complica los procesos de amplificación, secuenciación y genotipado. Estos procesos dependen del uso de los llamados cebadores complementarios a y capaces de hibridar con secuencias correspondientes de ácido nucleico del genoma de HCV. Debido al alto grado de variabilidad del genoma de HCV, los cebadores complementarios a una especie de HCV pueden no ser complementarios para otra especie.

Para determinar el subtipo de un aislado clínico de HCV un método preciso y directo es secuenciar el genoma viral en una región que es suficientemente divergente entre diversas especies para distinguir entre genotipos y subtipos de HCV consecuentemente. Se usa el análisis filogenético de las secuencias generadas a partir de estas regiones para determinar el subtipo de aislados clínicos.

Actualmente se están evaluando varios fármacos antivirales selectivos y potentes contra infección por virus de la hepatitis C crónica (HCV) en ensayos clínicos. La aparición de mutaciones de resistencia a fármacos se demostró en ensayos previos, creando una necesidad de controlar a los pacientes para el desarrollo de dichas mutaciones de resistencia a fármacos.

Para mejorar la identificación de los tipos y subtipos de HCV con fines de análisis clínico y la toma de decisiones terapéuticas por un médico asistente, sigue existiendo una necesidad continuada de mejorar los ensayos de HCV basados en secuenciación.

El virus de la hepatitis C está clasificado actualmente, como se ha mencionado anteriormente, en al menos 6 genotipos principales (Fig. 1). Cada genotipo difiere de los otros en un 3% a un 35% a nivel de nucleótidos y puede dividirse adicionalmente en varios subtipos con diversidad de secuencia típicamente entre el 2% y el 25% (Simmonds et al., Hepatology 25; 42(4), 962-973).

La presente invención se refiere al desarrollo de ensayos específicos de subtipo para el análisis de resistencia del genotipo de HCV adecuado para ensayos clínicos y documentos reguladores.

En más detalle, la invención se refiere a ensayos de genotipado que cubren la región codificante completa desde NS3 hasta NS5B desarrollados en un gran panel de muestras clínicas incluyendo protocolos para los subtipos 1a, 1b, 2a, 2b, 3a, 4ay4d.

La presente invención se refiere a un ensayo de subtipado basado en secuencia de NS5B que detecta los seis genotipos de HCV y discrimina entre los diferentes subtipos.

Un aspecto de la invención se refiere a un método para determinar mutaciones de resistencia a fármacos en cualquiera de las regiones de proteína no estructural NS3 a NS5B del virus de la hepatitis C (HCV) para los genotipos 1 a 6, más en particular para los genotipos específicos de subtipo 1a, 1b, 2a, 2b, 3a, 4a y 4d, presentes en

una muestra que comprende:

a) obtener dicha muestra de un paciente,

b) extraer el material genético viral de dicha muestra,

c) amplificar la reglón NS5B de HCV para generar un amplicón de ADN de 388 pares de bases usando cebadores que tienen las secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEC ID N° 1-5,

d) secuenciar el amplicón para obtener una secuencia de 329 pares de bases usando las secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEC ID N° 3-5,

e) realizar análisis de árboles filogenéticos usando la Información de secuencia de 329 pares de bases de NS5B para obtener información del subtipo de HCV en dicha muestra del paciente,

f 1) usar cebadores específicos de subtipo que tienen las secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEC ID N° 6-9, 42-45, 14-17. 12-123, 145-148 ó 18-183 para la generación de un amplicón de ADN que comprende la proteína no estructural NS3 (181 aminoácidos N-terminales),

g 1) secuenciar el amplicón de NS3 para obtener una secuencia de 543 pares de bases usando las secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEC ID N° 8 y 9; 43 y 45-46; 14 y 16; 12 y 122; 146 y 148 ó 18 y 182 o

f 2) usar cebadores específicos de subtipo que tienen las secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEC ID N° 13-16, 54 y 59-66, 124-133, 158 y 16-168 ó 194-197 para la generación de un amplicón de ADN que comprende la polimerasa NS5B,

g 2) secuenciar el amplicón de la polimerasa NS5B para obtener una secuencia de 1776 pares de bases usando las secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEC ID N° 15-16 y 87-92; 54, 59 y 61-66; 124 y 127-133; 158-159, 161 y 163-168 ó 197-24 o

f 3) usar cebadores específicos de subtipo que tienen las secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEC ID N° 3-33, 67-7, 93-96, 18-111, 134-137 ó 169-172 para la generación de un amplicón de ADN que comprende NS3/4A,

g 3) secuenciar el amplicón de la proteasa NS3/4A para obtener una secuencia de 255 pares de bases usando las secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEC ID N° 34-41; 68 y 71-77; 95 y 97-13; 112- 119; 136 y 138-144 ó 171 y 173-179 o

f 4) usar cebadores específicos de subtipo que tienen las secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEC ID N° 47-5, 78-81, 149-151 y 159 ó 184-187 para la generación de un amplicón de ADN que comprende NS4B/5A,

g 4) secuenciar el amplicón de NS4B/5A para obtener una secuencia de los dos genes NS4B y NS5A usando las secuencias seleccionadas entre el... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Métodos para determinar mutaciones resistencia a fármacos en cualquiera de las regiones de protema no estructural NS3 a NS5B del virus de la Hepatitis C (HCV) para los genotipos 1 a 6, más en particular para los genotipos específicos de subtipo 1a, 1b, 2a, 2b, 3a, 4a y 4d, presentes en una muestra que comprende:

a) obtener dicha muestra de un paciente,

b) extraer material genético viral de dicha muestra,

c) amplificar la región NS5B de HCV para generar un amplicón de ADN de 388 pares de bases usando cebadores que tienen secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEC ID N° 1-5,

d) secuenciar el amplicón para obtener una secuencia de 329 pares de bases usando las secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEC ID N° 3-5,

e) realizar análisis de árboles filogenéticos usando la información de secuencia de 329 pares de bases de NS5B para obtener información de subtipo de HCV en dicha muestra del paciente,

f 1) usar cebadores específicos de subtipo que tienen las secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEC ID N° 6-9, 42-45, 14-17, 12-123, 145-148 o 18-183 para la generación de un amplicón de ADN que comprende la proteína no estructural NS3 (181 aminoácidos N-terminales),

g 1) secuencia el amplicón de NS3 para obtener una secuencia de 543 pares de bases usando las secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEC ID N° 8 y 9; 43 y 45-46; 14 y 16; 12 y 122; 146 y 148 o 18 y 182 o

f2) usar cebadores específicos de subtipo que tienen las secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEC ID N° 13-16, 54 y 59-66, 124-133, 158 y 16-168 o 194-197 para la generación de un amplicón de ADN que comprende la polimerasa NS5B,

g 2) secuenciar el amplicón de la polimerasa NS5B para obtener una secuencia de 1776 pares de bases usando las secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEC ID N° 15-16 y 87-92; 54, 59 y 61-66; 124 y 127-133; 158-159, 161 y 163-168 o 197-24

o

f 3) usar cebadores específicos de subtipo que tienen las secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEC ID N° 3-33, 67-7, 93-96, 18-111, 134-137 o 169-172 para la generación de un amplicón de ADN que comprende NS3/4A,

g 3) secuenciar el amplicón de la proteasa NS3/4A para obtener una secuencia de 255 pares de bases usando las secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEC ID N° 34-41; 68 y 71-77; 95 y 97-13; 112- 119; 136 y 138-144o 171 y 173-179 o

f4) usar cebadores específicos de subtipo que tienen las secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEC ID N° 47-5, 78-81,149-151 y 159 o 184-187 para la generación de un amplicón de ADN que comprende NS4B/5A,

g 4) secuenciar el amplicón de NS4B y NS5A para obtener una secuencia de los dos genes NS4B y NS5A usando las secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEC ID N° 51-57; 79 y 81-87; 152-159 o 185 y 187-193;

h) alinear la secuencia obtenida en la etapa (g1), (g2), (g3) o (g4) con una secuencia de HCV de referencia o de tipo silvestre,

i) determinar una o más mutaciones de resistencia a fármacos en el material genético viral presente en la muestra del paciente.

2. Método de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende adicionalmente las etapas para realizar un ensayo de fenotipado de NS3 por

j) generación de un amplicón de NS3 partiendo del amplicón de ADN que comprende NS3 (181 aminoácidos N- terminales) obtenido en la etapa (f1) de la reivindicación 1 usando cebadores que tienen la secuencia de la SEC ID N° 11 y 12,

k) inserción, por clonación InFusion o recombinación in vitro, de dicho amplicón obtenido en la etapa (j) en un vector lanzadera que contiene marcador incompetente en replicación con NS3 delecionado que tiene la secuencia de la SEC ID N° 1 para obtener un replicón de HCV recombinante competente en replicación de NS3,

l) generación de ARN, por transcripción in vitro, a partir de dicho replicón de HCV obtenido en la etapa (k)

m) transfección de dicho ARN en células adecuadas,

n) determinación, en base a la expresión del gen marcador, del valor de CE5o y/o el cambio factorial como una medida para la presencia de mutaciones de resistencia a fármacos en una muestra.

3. Método de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende adicionalmente las etapas para realizar un ensayo de fenotipado de NS5B por

o) generación de un amplicón de NS5B partiendo del amplicón de ADN que comprende NS5B obtenido en la etapa (f2) de la reivindicación 1 usando cebadores que tienen la secuencia de la SEC ID N° 28 y 29,

p) inserción, por recombinación in vitro, de dicho amplicón obtenido en la etapa (o) en un vector lanzadera incompetente en replicación con NS5B delecionado que tiene la secuencia de la SEC ID N° 21 o SEC ID N° 27 para obtener un replicón de HCV recombinante competente en replicación de NS5B,

q) generación de ARN, por transcripción in vitro, de dicho replicón de HCV obtenido en la etapa (p)

r) transfección de dicho ARN en células adecuadas,

s) determinación, en base a la expresión del gen marcador, del valor de CE5 y/o el cambio factorial como una medida para la presencia de mutaciones de resistencia a fármacos en una muestra.

4. Uso del vector pFK 1341 Pl luc ANS3 7-192_ET (SEC ID N° 1) que comprende el genoma de HCV con una 1 deleción que abarca la región de 181 aminoácidos N-terminales de NS3 HCV en el método de acuerdo con la

reivindicación 2.

5. Uso del vector pFK_l341_PI_NS3-3_ET_dNS5a/b_5a44-5b591-Scal (SEC ID N° 21) que comprende el genoma de HCV con una deleción que abarca la región de NS5B de HCV o el vector pFK_l341_PI_NS3-

3_ET_dNS5a/b_5a44-5b591-Xbal (SEC ID N° 27) que comprende el genoma de HCV con una deleción que abarca

la región de NS5B de HCV en el método de acuerdo con la reivindicación 3.