DERIVADOS DE ALMIDON HIDROXIALQUILADO.

Un método de producir un derivado de hidroxialquil-almidón, que comprende hacer reaccionar un hidroxialquil-almidón de la fórmula (I) (Ver fórmula) en su extremo reductor que no está oxidado antes de dicha reacción,

con un compuesto de la fórmula (II) (Ver fórmula) en donde R1, R2 y R3 son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo lineal o ramificado, y en donde bien R'' o R" o bien R'' y R" comprenden al menos un grupo funcional X capaz de ser hecho reaccionar con al menos otro compuesto antes o después de la reacción de (I) y (II)

Derivados de almidón hidroxialquilado.

La presente invención se refiere a derivados de almidón hidroxietilado, particularmente derivados de almidón hidroxietilado que se pueden obtener mediante un procedimiento en el que el almidón hidroxietilado se hace reaccionar con un grupo amino primario o secundario de un compuesto de engarce. De acuerdo con una realización especialmente preferida, la presente invención se refiere a derivados de almidón hidroxietilado que se pueden obtener mediante un procedimiento de acuerdo con el cual el almidón hidroxietilado se hace reaccionar con un grupo amino primario o secundario de un compuesto de engarce y el producto de reacción resultante se hace reaccionar con un polipéptido, preferiblemente con una glicoproteína y especialmente preferiblemente con eritropoyetina, mediante al menos otro grupo reactivo del compuesto de engarce. Un almidón hidroxietilado que es especialmente preferido es almidón hidroxietilado. De acuerdo con la presente invención, el almidón hidroxietilado y preferiblemente el almidón hidroxietilado se hace reaccionar con el compuesto de engarce en su extremo reductor que no está oxidado antes de dicha reacción.

Almidón hidroxietilado (HES) es un derivado de la amilopectina de origen natural y se degrada por la alfa-amilasa en el cuerpo. HES es un derivado sustituido de la carbohidrato polímero amilopectina, que está presente en el almidón de maíz a una concentración de hasta 95% en peso. HES muestra propiedades biológicas ventajosas y se usa como agente de reemplazo de volumen de sangre y en la terapia de hemodilución en los centros sanitarios (Sommermeyer et al, 1987, Krankenhauspharmazie, 8 (8), 271-278; y Weidler et al, 1991, Arzneim.-Forschung/Drug Res., 41, 494-498).

La amilopectina consta de restos de glucosa, en la que en los enlaces de la cadena principal de alfa-1,4-glicosídicos están presentes y se han encontrado los lugares de ramificación de los enlaces alfa-1,6-glicosídicos. Las propiedades físico químicas de esta molécula se determinan principalmente mediante el tipo de enlaces glicosídicos. Debido a que el enlace alfa-1,4-glicosídico está roto, se producen las estructuras helicoidales con aproximadamente seis monómeros de glucosa por giro. Las propiedades fisicoquímicas así como las bioquímicas del polímero se pueden modificar mediante substitución. La introducción de un grupo hidroxietilo se puede lograr mediante hidroxietilación alcalina. Mediante la adaptación de las condiciones de reacción es posible explotar la reactividad diferente del grupo hidroxi respectivo en el monómero de glucosa no sustituido con respecto a una hidroxietilación. Debido a este hecho, los expertos en la técnica son capaces de influenciar el patrón de sustitución hasta un grado limitado.

Algunas formas de producir un derivado de almidón hidroxietilado se describen en la técnica.

El documento DE 26 16 086 describe la conjugación de hemoglobina con almidón hidroxietilado en la que, en una primera etapa, un agente de reticulación, por ejemplo bromociano, se une a almidón hidroxietilado y posteriormente la hemoglobina se une al producto intermedio.

Un campo importante en el que se usa HES es en la estabilización de polipéptidos que se aplican, por ejemplo, al sistema circulatorio con el fin de obtener un efecto fisiológico particular. Un ejemplo específico de estos polipéptidos es la eritropoyetina, una glicoproteína ácida de aproximadamente 34.000 kD que es esencial en la regulación del nivel de glóbulos rojos en la circulación.

Un problema bien conocido con la aplicación de polipéptidos y enzimas es que estas proteínas muestran a menudo una estabilidad no satisfactoria. Especialmente eritropoyetina tiene una semivida en plasma relativamente corta (Spivak and Hogans, 1989, Blood 73, 90; McMahon et al, 1990, Blood 76, 1718). Esto significa que los niveles en plasma terapéuticos se pierden rápidamente y se debe llevar a cabo la administración intravenosa repetida. Además, en ciertas circunstancias, se observa una respuesta inmune contra los péptidos.

En general se acepta que la estabilidad de los polipéptidos se puede mejorar y la respuesta inmune frente a estos polipéptidos se reduce cuando los polipéptidos están acoplados a moléculas poliméricas. El documento WO 94/28024 describe que los polipéptidos fisiológicamente activos modificados con polietilenglicol (PEG) muestran una inmunogenicidad y antigenicidad reducida y circulan en el torrente sanguíneo considerablemente más tiempo que las proteínas no acopladas, Es decir, tienen una velocidad de eliminación más larga Sin embargo, los conjugados PEG-fármaco muestras varias desventajas, por ejemplo, no muestran una estructura natural que se puede reconocer por los elementos de las rutas de degradación in vivo. Por lo tanto, aparte de los conjugados de PEG, se han producido otros conjugados y polímeros de proteínas. Se han descrito una pluralidad de procedimientos para la reticulación de diferentes proteínas y macromoléculas tales como polimerasa en la bibliografía (véase por ejemplo, Wong, Chemistry of protein conjugation and cross-linking, 1993, CRCS, Inc.

Los conjugados de HES-fármaco descritos en la técnica padecen la desventaja que HES no está conjugado de manera específica al fármaco. Por consiguiente, la conjugación da como resultado cualquier producto heterogéneo que tiene muchos componentes que pueden ser inactivos debido a la destrucción de la estructura de 3 dimensiones durante la etapa de conjugación. Por lo tanto, existe una necesidad de conjugados de HES-polipéptidos adicionales mejorados con estabilidad y/o bioactividad mejorada.

Un procedimiento de producción de estos conjugados usa, como material de partida, una forma oxidada de HES que se hace reaccionar con un compuesto de reticulación en el que el producto resultante se hace reaccionar con un polipéptido o modificado adicionalmente y posteriormente se hace reaccionar con un polipéptido. Una desventaja principal de este procedimiento es que en una primera etapa, el HES original se tiene que oxidar de manera selectiva, en general en su extremo reductor, mediante oxidación del grupo aldehído terminal y/o grupo hemiacetal a una lactona, de este modo haciendo el procedimiento global más difícil y caro.

El documento WO 02/080979 A2 describe compuestos que comprenden un conjugado de un agente activo y un almidón hidroxietilado en los que el agente activo y almidón hidroxietilado están o bien unidos directamente o mediante un compuesto de engarce. Con referencia al enlace directo, la reacción del agente activo y el almidón hidroxialquilado se lleva a cabo en un medio acuoso que comprende al menos 10% en peso de agua. No se proporcionan ejemplos que se refieran a un derivado de almidón hidroxietilado que se produce mediante reacción de almidón hidroxietilado en su extremo reductor con un compuesto reticulado que comprende la unidad de estructura -NH- en un medio acuoso. Todos los ejemplos se refieren a almidón hidroxietilado que se oxida antes de de una reacción adicional, la enseñanza específica del documento WO 02/080979 A2 que tienen las desventajas anteriormente mencionadas.

Thomas et al., Crit Care Med 2000, vol. 28, No. 3, describen la reacción de almidón hidroxietilado con diclorhidrato de putrescina para reducir la base de Schiff formada de esta manera mediante un complejo borano/piridina y para reaccionar el almidón hidroxietilado aminado así obtenido con isocianato fluorescente para obtener un almidón hidroxietilado fluorescente. Thomas et al. no describen el uso de un polipéptido en esta reacción, es decir, la reacción de almidón hidroxietilado con un compuesto de engarce y la reacción del producto obtenido con un polipéptido no se describe en el documento.

Thomas et al. Documento WO 03/074087 describe el acoplamiento de proteínas a un polisacárido modificado. Para las funciones de unión de SH y CHO, BMPH, EMCA, KMUH, M2C2H, MPBH y PDPH se describen como moléculas de engarce específicas. El uso de las moléculas de engarce, en particular el uso de las moléculas de engarce mencionadas anteriormente, no se describe en ninguno de los ejemplos del documento WO 03/074087.

Por lo tanto, es un objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento de producción de un derivado de almidón hidroxietilado que permite reaccionar el almidón hidroxietilado en su extremo reductor con un compuesto adecuado en el que el extremo reductor del almidón no está oxidado antes de la reacción.

Es un objeto adicional de la presente...

1. Un procedimiento de producción de un derivado de almidón hidroxietilado que comprende hacer reaccionar almidón hidroxietilado de fórmula (I)

en su extremo reductor que no está oxidado antes de la reacción, con un compuesto de fórmula (II)

(II)R'-NH-R''

en la que R₁, R₂ y R₃ son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo lineal o ramificado, y en la que o bien R' o R'' o R' y R'' comprenden al menos un grupo funcional X capaz de hacerse reaccionar con al menos otro compuesto antes o después de la reacción de (I) y (II), y en la que el compuesto (II) se hace reaccionar mediante el grupo NH que une mediante puentes R' y R'' con el compuesto (I) en su extremo reductor que no está oxidado; y

- en la que el producto de reacción del compuesto (I) y el compuesto (II) se hace reaccionar con un grupo funcional Y de un compuesto adicional mediante el al menos un grupo funcional X y el al menos un compuesto adicional es un polipéptido; o

- en la que el producto de reacción del compuesto (I) y el compuesto (II) se hace reaccionar con un compuesto adicional mediante el al menos un grupo funcional X y el al menos un compuesto adicional es un compuesto de reticulación y el producto de reacción con el compuesto de reticulación se hace reaccionar con un grupo funcional Y de un segundo compuesto adicional y el segundo compuesto adicional es un polipéptido;

con la condición de que si el producto de reacción del compuesto (I) y el compuesto (II) se hace reaccionar con un grupo funcional Y de un compuesto adicional mediante el al menos un grupo funcional X y el al menos un compuesto adicional es un polipéptido, el compuesto de fórmula (II) no es BMPH (N-(ácido beta-maleimidopropiónico) hidrazida TFA); EMCA (N-(ácido epsilon-maleimidocaproico) hidrazida), KMUH (N-(ácido kappa-maleimidoundecanoico) hidrazida), M₂C₂H (4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxil-hidrazida HCl), MPBH (4-(ácido 4-N-maleimidofenil)butírico hidrazida HCl), PDPH (3-(2-piridilditio)-propionil hidrazida).

2. Un procedimiento de la reivindicación 1, en el que el grupo funcional Y es

o un resto carbohidrato que puede estar ligado al polipéptido mediante N-glicosilación u O- glicosilación.

3. Un procedimiento según la reivindicación 1 ó 2 en el que el almidón hidroxietilado es almidón hidroxietilado.

4. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que R₁, R₂ y R₃ son independientemente hidrógeno o un grupo 2-hidroxietilo.

5. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en el que R' es hidrógeno o un grupo lineal o ramificado alquilo o alcoxi, preferiblemente hidrógeno o un grupo metilo o un grupo metoxi.

6. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en el que aparte del grupo funcional X, R'' comprende al menos un grupo funcional adicional W que está directamente unido al grupo NH que une por puentes R' y R'', seleccionándose dicho grupo funcional W entre el grupo constituido por

y

donde G es O o S y, si está presente dos veces, G es independientemente O o S.

7. Un procedimiento según la reivindicación 6 en el que, si R' es H, R' y el grupo NH que une por puentes R' y R'' forman, conjuntamente con W, uno de los siguientes grupos

8. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en el que el al menos un grupo funcional X se selecciona entre el grupo constituido por -SH, -NH₂, -O-NH₂, -NH-O-alquilo, -(C=G)-NH-NH₂, -G-(C=G)-NH-NH₂, -NH-(C=G)-NH-NH₂, y -SO₂-NH-NH₂ donde G es O o S y, si G está dos veces, es independientemente O o S.

9. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 u 8 en el que el compuesto de acuerdo con la fórmula (II) es O-[2-(2-aminooxietoxi)-etil]-hidroxil amina o carbohidrazida.

10. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en el que la reacción del compuesto (I) y el compuesto (II), siendo el compuesto (II) una hidroxilamina o una hidrazida, se lleva a cabo a una temperatura de entre 5 y 45ºC y a un pH en el intervalo de entre 4,5 y 6,5 en un medio acuoso.

11. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en el que la reacción del compuesto (I) y el compuesto (II), siendo dicha reacción una aminación reductora, se lleva a cabo a una temperatura de entre 25 y 90ºC and a un pH en el intervalo de entre 8 y 12 en un medio acuoso.

12. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 10 o 11 en el que el producto de reacción del compuesto (I) y el compuesto (II) se hace reaccionar con un compuesto adicional mediante el al menos un grupo funcional X, siendo el compuesto adicional un polipéptido, preferiblemente eritropoyetina, y en el que el al menos un compuesto adicional se hace reaccionar mediante un grupo tio o un resto carbohidrato oxidado comprendido en el al menos un compuesto adicional.

13. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 9 en el que la reacción se lleva a cabo a una temperatura en el intervalo de entre 4 y 37ºC y/o en un medio acuoso.

14. Un procedimiento según la reivindicación 1 en el que el segundo compuesto adicional se hace reaccionar mediante un grupo tio o un resto carbohidrato oxidado comprendido en el al menos un compuesto adicional.

15. Un derivado de almidón hidroxietilado que se pueden obtener mediante un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 con la condición de que el producto de reacción del compuesto de fórmula (II) y el compuesto adicional que tiene un grupo funcional Y y que es un polipéptido no sea insulina.

16. Un derivado de almidón hidroxietilado según la reivindicación 15 en el que dicho derivado tiene una constitución de acuerdo con la fórmula (IIIa)

17. Un derivado de almidón hidroxietilado según la reivindicación 15 en el que R' es hidrógeno y en el que el derivado es o bien un compuesto de fórmula (IIIa) o un compuesto de fórmula (IIIb) o una mezcla de compuestos de fórmulas (IIIa) y (IIIb)

18. Una composición farmacéutica que comprende, en una cantidad terapéuticamente eficaz, un derivado de almidón hidroxietilado según la reivindicación 15.

19. Una composición farmacéutica según la reivindicación 18 en la que el polipéptido, preferiblemente eritropoyetina, se hace reaccionar con el producto de reacción del compuesto (I) y el compuesto (II) mediante un resto carbohidrato oxidado comprendido en el polipéptido.

20. Una composición farmacéutica según la reivindicación 19 en la que almidón hidroxietilado se hace reaccionar en un medio acuoso con un compuesto de acuerdo con la siguiente fórmula

y el producto de reacción se hace reaccionar con eritropoyetina.

21. Una composición farmacéutica según la reivindicación 20 en la que la eritropoyetina se oxida con peryodato de sodio antes de la reacción.

22. Una composición farmacéutica según la reivindicación 20 en la que la eritropoyetina está parcialmente desializada y posteriormente oxidada con peryodato de sodio antes de la reacción.