Método para preparar conjugados de carbohidrato-glicopéptido de antígeno múltiple.

Un método para preparar un conjugado de epitopo de células T que contiene carbohidratos de fórmula

(I):

M(T-B)n (I)

en la que:

- M es un núcleo de polilisina dendrimérico;

- T es un epitopo de células T;

- B es un epitopo de células B que contiene carbohidratos que comprende al menos un resto carbohidrato (b);

- n es un número entero y representa el número de grupos -T-B unidos covalentemente a M;

y dicho método comprende las etapas de:

i) acoplar un epitopo de células B que contiene carbohidratos protegido (BPr), cuyos grupos hidroxilo del resto carbohidrato (b) están protegidos con un grupo protector (Pr), con un compuesto M(T)n, formando con ello un conjugado de epitopo de células T que contiene carbohidratos M(T-BPr)n, seleccionándose dicho grupo protector (Pr) del grupo que consiste en alilo, p-metoxibencilo (PMB), t-butildimetilsililo (TBDMS), benciloximetilo (BOM), levulinilo (Lev), benzoílo (Bz), 2,5-difluorobenzoílo, cloroacetilo, bencilo (Bn) o un acetilo (Ac), o formando, con los dos grupos hidroxilo a los cuales está unido, un isopropilidén cetal C5-C6 o un alquilcarbonato cíclico C5-C6; y

ii) retirar los grups protectores Pr del conjugado M(T-BPr)n obtenido, obteniendo con ello el conjugado de epitopo de células T que contiene carbohidratos M(T-B)n.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/IB2012/051285.

Solicitante: INSTITUT PASTEUR.

Nacionalidad solicitante: Francia.

Dirección: 28 rue du Docteur Roux 75015 Paris FRANCIA.

Inventor/es: BAY, SYLVIE, LECLERC, CLAUDE, LO-MAN, RICHARD.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > A61K39/00 (Preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos (materiales para ensayos inmunológicos G01N 33/53))
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales caracterizadas por los... > A61K47/48 (estando el ingrediente no activo químicamente unido al ingrediente activo, p. ej. conjugados polímero-medicamento)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > C07K9/00 (Péptidos de hasta 20 aminoácidos, que contienen radicales sacáridos y una secuencia totalmente determinada; Sus derivados)

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Fragmento de la descripción:

Método para preparar conjugados de carbohidrato-gücopéptído de antígeno múltiple

La presente invención se refiere a un método para preparar conjugados de epitopos de células T que contienen carbohidratos de fórmula (I), y a intermedios de epitopos de células T que contienen carbohidratos de fórmula (II) 5 útiles según dicho método.

Durante la última década se ha desarrolado el MAG-Tn3, un nuevo tipo de inmunógeno sintético que muestra el antígeno Tn asociado a tumor. El MAG-Tn3 es un glicopéptido totalmente sintético (PM = 10.897 Da) que asocia el antígeno Tn que contiene carbohidratos (como una agrupación tri-Tn) a un epitopo de células T CD4* peptídico sobre un esqueleto tetravalente [5, 9].

**(Ver fórmula)**

MAG-Tn3

MAG-Tn3 se corresponde con la siguiente estructura [S(ot-D-GalNAc)-T(ot-D-GalNAc)-T(ot-D-GalNAc)- QY^IKANS^°KFIGI^TEL]4-K2-K-p-Ala:

MAG se refiere a glicopéptido de antígeno múltiple.

T"3-T^ T"3

KKK

y \

TngT T-Tn.,

15 Así, MAG-Tn3 se corresponde con un conjugado de carbohidrato y péptido B4-T4-M con la siguiente fórmula: en la que:

- KKK es el núcleo de polilisina dendrítico (M),

- T es el epitopo de células T CD4* peptídico que tiene la siguiente secuencia: QYIKANSKFIGITEL,

- Tn3 es el epitopo de células B tri-Tn que tiene la siguiente secuencia: (a-GalNAc)Ser-(a-GalNAc)Thr-(a- 20 GalNAc)Thr.

Basándose en los resultados obtenidos con éxito /n wvo en ratones y primates [8, 9], el MAG-Tn3 es un buen candidato a vacuna teraéputica para tratar carcinomas que debería avanzar hacia un ensayo clínico de fase l/H.

Una vía sintética para preparar conjugados de carbohidratos y péptidos, tales como, de forma notable, MAG-Tn3, se ha descrito en la solicitud de patente internacional WO 98/43677 y en la patente de EEUU n.° 6.676.946. En este 25 proceso, realizado a pequeña escala (1-10 mg de compuesto final), el antígeno Tn3 que contiene carbohidratos se incorpora al bloque constituyente de péptido dendrimérico M(T)4. Debe advertirse que la incorporación del antígeno Tn3 se logra con el azúcar totalmente desprotegido, lo cual puede parecer ventajoso puesto que se evita una etapa de desprotección final.

Sin embargo, los inventores han demostrado que este método fracasa cuando se aumenta de escala. En efecto, la 30 incorporación de restos Tn extra es difícil de controlar y afecta a la pureza bruta y al rendimiento global. Además, la purificación de este glicopéptido de alto peso molecular es compleja.

Así, es necesario un método mejorado para preparar MAG-Tn3 que supere los inconvenientes de la técnica anterior, en particular que permita obtener unos mejores rendimientos y pureza, de forma notable a mayor escala y de una manera repetible.

Así, la presente invención, en un aspecto, proporciona un nuevo proceso para preparar MAG-Tn3, y más en general conjugados de epitopos de células T que contienen carbohidratos de fórmula (I) (M(T-B)n, que permite una producción a gran escala, con mejor rendimiento y pureza:

nBpr + M(T), -> M(T-Bpr)n, (II) M(T-B) (I)

El método según la Invención permite, de forma ventajosa, minimizar los subproductos de la síntesis, mejorar la robustez del proceso, y aumentar la escala de la síntesis de una manera repetlble.

De modo más específico, se ha descubierto que la protección de los grupos hldroxllo del epltopo de células B que contiene carbohidratos con un grupo protector adecuado (Pr), antes de Incorporar el epltopo de células B al bloque constituyente M(T)n, permite un mejor control de la Incorporación del epltopo de células B y, así, se mejora el rendimiento y la pureza, en particular a gran escala.

Otro objeto de la presente Invención es proporcionar nuevos conjugados de epitopos de células T que contienen carbohidratos de fórmula (II) (M(T-Bpr)n), siendo dichos compuestos útiles para la preparación de conjugados de epitopos de células T que contienen carbohidratos de fórmula M(T-B)n con mayor rendimiento y pureza.

Otro objeto es proporcionar conjugados de epitopos de células T que contienen carbohidratos de fórmula (I) (M(T- B)n) que tienen un grado de pureza mayor que 95% que pueden obtenerse mediante el proceso según la Invención.

Estos y otros objetos, características y ventajas del método según la Invención se describirán en la siguiente descripción detallada de la memoria descriptiva de la patente.

Así, en un aspecto, la presente Invención se refiere a un método para preparar un conjugado de epltopo de células T que contiene carbohidratos de fórmula (I):

M(T-B).(I)

en la que:

M es un núcleo de pollllslna dendrlmérlco;

T es un epltopo de células T que comprende un péptldo;

B es un epltopo de células B que contiene carbohidratos que comprende al menos un resto carbohidrato (b); n es un número entero y representa el número de grupos -T-B unidos covalentemente a M; y dicho método comprende las etapas de:

I) acoplar un epitopo de células B que contiene carbohidratos protegido (Bpr), cuyos grupos hidroxilo del resto carbohidrato (b) están protegidos con un grupo protector (Pr), con un compuesto M(T)n, formando con ello un conjugado de epitopo de células T que contiene carbohidratos M(T-Bpr)n, seleccionándose dicho grupo protector (Pr) del grupo que consiste en alilo, p-metoxibencilo (PMB), f-butildimetilsililo (TBDMS), benciloximetilo (BOM), levulinilo (Lev), benzoílo (Bz), 2,5-difluorobenzoílo, cloroacetilo, bencilo (Bn) o un acetilo (Ac), o formando, con los dos grupos hidroxilo a los cuales está unido, un isopropilidén cetal C5-C6 o un alquilcarbonato cíclico C5-C6; y

¡i) retirar los grups protectores Pr del conjugado M(T-Bpr)n obtenido, obteniendo con ello el conjugado de epitopo de células T que contiene carbohidratos M(T-B)n.

/Vúc/eo de poM/s/na dendr/mér/co (M)

El núcleo de polilisina del conjugado de fórmula (I) es una estructura dendrimérica, que puede representarse como una estrella que tienen múltiples ramificaciones (-T-B), que pueden o no ser idénticas.

Estas ramificaciones están unidas covalentemente al extremo NH2 de cada resto lisina del núcleo dendrimérico, de forma notable a través de un enlace peptídico -NH-C(=0)-.

La valencia m del núcleo de polilisina dendrimérico (M), es decir, el número de extremos NH2 de cada resto lisina, es tal que m > n, preferiblemente m = n, siendo n el número de ramificaciones (-T-B) unidas covalentemente a M.

En otro aspecto, el número de ramificaciones (-T-B) n varía de 4 a 16, de forma notable de 4 a 8.

En otro aspecto, el núcleo de polilisina dendrimérico M comprende al menos 3 restos lisina, en particular de 3 a 15 restos lisina, más en concreto de 3 a 7 restos lisina.

En otro aspecto, el conjugado M(T-B)n se selecciona de las siguientes fórmulas (la) o (Ib):

KKK (ta)

/ \

B-T T-B

B

/

T

/

BTK

**(Ver fórmula)**

BTK \

T

\

B

B

\

T

\

KT-B

/

KK

\

KT-B /

T

/

B

(!b)

en las que:

K es un resto Usina, y T y B son como se definió anteriormente.

De forma ventajosa, las estructuras dendriméricas (la) y (Ib) proporcionan una alta densidad de antígenos sobre la 5 superficie del núcleo de polilisina dendrimérico M.

En otro aspecto, M es (KjíK-pAla-OH de la siguiente fórmula:

**(Ver fórmula)**

f?a/77/'f/cac/ones (T-B)

La presencia de epitopos de células T y epitopos de células B que contienen carbohidratos sobre el conjugado de fórmula (I) hace que este sea un inmunógeno... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1.- Un método para preparar un conjugado de epitopo de células T que contiene carbohidratos de fórmula (I):

M(T-B),(I)

en la que:

5 - M es un núcleo de pollllslna dendrlmérlco;

- T es un epitopo de células T;

- B es un epitopo de células B que contiene carbohidratos que comprende al menos un resto carbohidrato (b);

- n es un número entero y representa el número de grupos -T-B unidos covalentemente a M; y dicho método comprende las etapas de:

10 I) acoplar un epitopo de células B que contiene carbohidratos protegido (Bpr), cuyos grupos hldroxllo del resto carbohidrato (b) están protegidos con un grupo protector (Pr), con un compuesto M(T)n, formando con ello un conjugado de epitopo de células T que contiene carbohidratos M(T-Bpr)n, seleccionándose dicho grupo protector (Pr) del grupo que consiste en aillo, p-metoxlbencllo (PMB), f-butlldlmetllsllllo (TBDMS), benclloxlmetllo (BOM), levullnilo (Lev), benzoílo (Bz), 2,5-dlfluorobenzoílo, cloroacetllo, bencllo (Bn) o un acetllo (Ac), o formando, con los dos grupos 15 hldroxllo a los cuales está unido, un ¡sopropllldén cetal C5-C6 o un alqullcarbonato cíclico C5-C6; y

¡I) retirar los grups protectores Pr del conjugado M(T-Bpr)n obtenido, obteniendo con ello el conjugado de epitopo de células T que contiene carbohidratos M(T-B)n.

2 - El método de la reivindicación 1, en el que M(T-B)n se selecciona de las siguientes fórmulas (la) o (Ib):

BT TB

VKt/ (ta)

/ \

B-T T-B

B

/

T

/

BTK

\

K /

BTK \

T

\

B

**(Ver fórmula)**

\

KT-B

/

KK

\

KT-B

/

T

/

B

Cb)

en las que K es un resto Usina, y

Ty B son como se define en la reivindicación 1.

3 - El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que M es (K)2K-pAla-OH de fórmula:

**(Ver fórmula)**

4.- El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que T es un epltopo de células T que comprende un péptldo.

5.- El método de la reivindicación 4, en el que T es o comprende un epltopo de células T CD8* o CD4*.

6.- El método de la reivindicación 5, en el que T es o comprende un epltopo de células T CD4*.

7.- El método de la reivindicación 6, en el que T es o comprende un fragmento de proteína de pollovlrus (PV), un fragmento de la toxina del tétanos, o un péptldo PADRE.

8 - El método de la reivindicación 7, en el que T es es un péptldo que consiste en QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO:1).

9 - El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el resto carbohidrato (b) está unido a un resto aminoácido, péptldo o lípldo.

10 - El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que B es o comprende un resto carbohidrato seleccionado del grupo que consiste en:

- a-GalNAc-Ser,

- a-GalNAc-Thr,

- pGalNAc-Ser,

- p-GalNAc-Thr,

- p-Gal-(1-3)-a-GalNAc-Ser,

- p-Gal-(1-3)- a-GalNAc-Thr,

- (a-GalNAc-Ser/Thr)2,

- (a-Ga¡NAc-Ser/Thr)3, y

- (a-GalNAc-Ser/Thr)6.

11.- El método de la reivindicación 10, en el que B es o comprende el resto (a-GalNAc-Ser/Thr)3.

12.- El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el grupo protector Pr es bencllo (Bn) o acetllo (Ac).

13.- El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa I) comprende las etapas de:

a) acoplar un primer resto carbohidrato protegido (bpr), cuyos grupos hldroxllo están protegidos con un grupo protector (Pr) según se define en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, con un compuesto M(T)n, formando con ello un conjugado de epltopo de células T que contiene carbohidratos M(T-bpr)n; y

b) repetir la etapa a) con más restos carbohidrato protegidos (bpr) hasta obtener un conjugado de carbohidrato protegido de fórmula (II) M(T-Bpr)n.

14 - El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que Pr es bencllo.

15 - El método de la reivindicación 14, en el que los grupos bencilo se retiran en presencia de TfOH o H2.

16 - El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que Pr es acetilo.

17 - El método de la reivindicación 16, en el que los grupos acetilo se retiran en presencia de hidrazina o MeONa.

18 - Un conjugado de epitopo de células T que contiene carbohidratos de fórmula (II):

M(T-Bpr)n (II)

en la que:

- M es un núcleo de polilisina dendrimérico;

5 - Tes un epitopo de células T;

- Bpr es un epitopo de células B que contiene carbohidratos protegido, que comprende al menos un resto carbohidrato (b), cuyos grupos hidroxilo están protegidos con un grupo Pr según se define en la reivindicación 1; y

- n es un número entero y representa el número de grupos -T-B unidos covalentemente a M.

19 - El conjugado de epitopo de células T que contiene carbohidratos de la reivindicación 18, en el que T es o 10 comprende un péptido.

20 - El conjugado de epitopo de células T que contiene carbohidratos de cualquiera de las reivindicaciones 18 o 19, en el que Pr es bencilo (Bn) o acetilo (Ac).

21- El conjugado de epitopo de células T que contiene carbohidratos de cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, en el que Bpr es un (a-GalNAc-Ser/Thr)3 protegido.

15 22 - El conjugado de epitopo de células T que contiene carbohidratos de cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21,

en el que M es HO-)5Ala-K(K)2.

23 - El conjugado de epitopo de células T que contiene carbohidratos de cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22, en el que T es QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO:1).

24 - El uso de un conjugado de epitopo de células T que contiene carbohidratos M(T-Bpr)n de cualquiera de las 20 reivindicaciones 18 a 23, para preparar un conjugado de carbohidrato y péptido M(T-B)n según se define en

cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17.