Un procedimiento para reducir niveles de H2S en un medio de fermentación,

procedimiento que comprende poner en contacto el medio de fermentación con una célula de levadura que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido MET10 que no cataliza la conversión de sulfito en sulfuro, en el que el aminoácido en la posición 662 del polipéptido MET10 es Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Val, Trp o Tyr (SEC ID Nº: 5) .

Composiciones y procedimientos para reducir niveles de H2S en bebidas fermentadas.

Referencias cruzadas a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud de patente provisional de EE.UU. nº 60/918.616 presentada el 16 de marzo de 2007 y la solicitud provisional de EE.UU. nº 60/959.366 presentada el 12 de julio de 2007.

Declaración de los derechos a invenciones hechas bajo investigación y desarrollo federalmente patrocinadas

No aplicable.

Antecedentes de la invención

La producción de compuestos de azufre volátiles tales como sulfuro de hidrógeno (H2S) durante la fermentación alcohólica es un asunto que afecta a las industrias cerveceras y vitivinícolas. El sulfuro de hidrógeno (H2S) es un subproducto no deseable de la vía de reducción de sulfato (Figura 1) . Se forma en Saccharomyces cerevisiae bajo condiciones de fermentación. La producción de H2S por cepas de S. cerevisiae oscila de 0 ug/l a 290 ug/l, muy por encima del umbral de detección humano de 11 ng/l (Amoore y Hautala 1983) . Su calidad no deseable procede del hecho de que introduce un olor a huevo podrido característico a los vinos y, aunque el H2S es un compuesto volátil y puede eliminarse por aireación, tiene la posibilidad de formar mercaptanos y tioles que persistirán en el vino debido al bajo pH (Thoukis 1962) . Los mercaptanos y tioles presentan por sí mismos aromas a cebolla o verduras enlatadas y si el H2S volátil puede controlarse, la eliminación de otros compuestos de azufre no deseados es técnicamente difícil y despoja al vino de otros compuestos de aroma.

La formación de sulfuro de hidrógeno por Saccharomyces cerevisiae es un problema bien documentado en la industria del vino, la cerveza y el sake (Acree y col. 1972, Eschenbruch y col. 1978, Giudici y Kunkee 1994, Jiranek y col. 1995, Rauhut y Kurbel 1994, Walker y Simpson 1993) . Factores nutricionales tales como niveles de nitrógeno, vitaminas y cofactores (Giudici y Kunkee 1994, Jiranek y col. 1995) y factores medioambientales tales como temperatura, pH, niveles de azufre elemental (Rauhut y Kurbel 1994) , presencia de dióxido de azufre (Stratford y Rose 1985) y niveles de compuestos orgánicos que contienen azufre (Acree y col. 1972) se han asociado a la producción de compuestos de azufre volátiles en bebidas fermentadas. Las diferencias en la producción de compuestos de azufre volátiles también se han atribuido a las diferencias en el metabolismo de las cepas de levadura (Acree y col. 1972, Spiropoulos y col. 2000) .

Hay al menos seis clases diferentes de comportamiento de cepas de levadura con respecto a la formación de sulfuro de hidrógeno: 1) niveles elevados bajo todas las condiciones; 2) niveles bajos bajo todas las condiciones; 3) producción elevada por encima y por debajo de un nivel umbral de nitrógeno; producción reducida durante una 'ventana' de niveles de nitrógeno con sulfuro creciente a niveles de nitrógeno por encima o por debajo de esta ventana; 4) producción elevada en respuesta a niveles de micronutrientes limitantes independientemente del contenido de nitrógeno; 5) producción elevada de sulfuro sólo cuando se limita para tanto nitrógeno como micronutrientes; y 6) producción elevada de sulfuro con tasa elevada de fermentación, que puede relacionarse con la tasa de fermentación y desprendimiento de dióxido de carbono o con algún otro factor tal como la producción elevada de calor (Spiropoulos 2000, Jiranek 1995, Giudici 1994, Linderholm 2006) .

El procedimiento existente para separar sulfuros de vino es la clarificación en cobre. La adición de cobre puede conducir a la catálisis de cambios en la composición perjudiciales, además de aumentar la cantidad de residuos producidos por las bodegas que requieren tratamiento especial, produciendo en último ligar mayores costes de producción para las bodegas y mayores costes del vino para el consumidor. Además, el uso de cobre como agente de clarificado puede conducir a altos niveles de cobre residuales en el vino. La Trade and Tax Bureau permite un nivel de cobre residual de 0, 5 mg/l para vino (véase, por ejemplo, la página web regulations.justia.com/view/89060/) . Los enólogos que usan cobre para eliminar el sulfuro de hidrógeno deben luego tomar medidas para reducir los niveles de cobre en el vino. Dados los efectos adversos para la salud asociados a la excesiva ingestión de cobre, particularmente trastornos neurológicos tales como Alzheimer, la Organización mundial de la salud ha recomendado restricciones dietéticas al consumo de este compuesto (véase la página web who.int/watersanitation health/dwq/chemicals/copper.pdf) . La disponibilidad de cepas de levadura comerciales que no pueden producir sulfuro de hidrógeno o que producen niveles reducidos de sulfuro de hidrógeno eliminará la necesidad del tratamiento con cobre de vinos. El nº de acceso de la base de datos EBI EF058164 desvela la CDS completa del gen de subunidad alfa de la sulfito reductasa (MET10) de la cepa aislada de Saccharomyces cerevisiae UCD932. Spiropoulos y col., Applied and Environmental Microbiology, 2000; 66 (10) : 4421 a 4462 desvela MET17 y la formación de sulfuro de hidrógeno en Saccharomyces cerevisiae.

Por tanto, hay una necesidad en la materia para composiciones y procedimientos para reducir niveles de H2S en

bebidas fermentadas. La presente invención cumple estas y otras necesidades.

Breve resumen de la invención

La presente invención proporciona composiciones y procedimientos para reducir niveles de H2S en bebidas fermentadas.

Un aspecto de la invención proporciona procedimientos para reducir o eliminar niveles de H2S en el producto o medio de fermentación. En particular, la invención proporciona un procedimiento para reducir niveles de H2S en un medio de fermentación, procedimiento que comprende poner en contacto el medio de fermentación con una célula de levadura que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido MET10 que no cataliza la conversión de sulfito en sulfuro, en el que el aminoácido en la posición 662 del polipéptido MET10 es Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Val, Trp o Tyr (SEC ID Nº: 5) .

Con respecto a las realizaciones de un polipéptido MET10 inactivo para sulfuro, el residuo de aminoácido en la posición 662 del polipéptido MET10 no es treonina o serina. El residuo de aminoácido en la posición 662 del polipéptido MET10 es Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Val, Trp o Tyr (SEC ID Nº: 5) . En algunas realizaciones, el residuo de aminoácido en la posición 662 está seleccionado del grupo que consiste en Lys, Arg, His, Gln y Asn (SEC ID Nº: 6) . En algunas realizaciones, el residuo de aminoácido en la posición 662 es Lys (SEC ID Nº: 7) .

En algunas realizaciones, el polipéptido MET10 o polinucleótido MET10 inactivo para sulfuro es un MET10 de levadura. En algunas realizaciones, el polipéptido MET10 inactivo para sulfuro comparte al menos aproximadamente el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor identidad de secuencias con un MET10 de SEC ID Nº: 3 o SEC ID Nº: 4 en el que X en la posición 662 es como se ha descrito anteriormente y en el presente documento. En algunas realizaciones, el polinucleótido que codifica un polipéptido MET10 inactivo para sulfuro comparte al menos aproximadamente el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor identidad de secuencias con SEC ID Nº: 1.

En algunas realizaciones, la célula de levadura tampoco expresa un polipéptido MET10 activo para sulfuro que puede convertir sulfito en sulfuro. En algunas realizaciones, el producto de fermentación es vino, cerveza o champán. En algunas realizaciones, los medios de fermentación pueden seleccionarse del grupo que consiste en un mosto de fruta (por ejemplo, un mosto de zumo de uva) o un mosto de grano.

Con respecto a las realizaciones de células de levadura, en algunas realizaciones, la cepa de levadura puede ser una cepa de Saccharomyces cerevisiae. En algunas realizaciones, la cepa de levadura puede ser cualquier cepa comercialmente disponible para su uso en la fabricación de cerveza o vino, como se describe en el presente documento. Frecuentemente, la cepa parental o cepa de origen es una productora de sulfuro de hidrógeno que ha sido convertida en una no productora de sulfuro de hidrógeno por sustitución del ácido nucleico que codifica un polipéptido MET10 activo para sulfuro con un ácido nucleico que codifica un polipéptido... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para reducir niveles de H2S en un medio de fermentación, procedimiento que comprende poner en contacto el medio de fermentación con una célula de levadura que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido MET10 que no cataliza la conversión de sulfito en sulfuro, en el que el aminoácido en la posición 662 del polipéptido MET10 es Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Val, Trp o Tyr (SEC ID Nº: 5) .

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que:

a) se produce una bebida fermentada, en el que la bebida fermentada está seleccionada opcionalmente de vino, cerveza, champán, oporto y madeira; b) el polinucleótido codifica un polipéptido MET10 de SEC ID Nº: 34, en el que X en la posición 662 es Lys, Arg, His, Gln, Asn, Glu, Asp, Ile, Leu, Val, Phe, Tyr o Trp; c) el polinucleótido codifica un polipéptido MET10 de SEC ID Nº: 6, en el que X en la posición 662 es Lys, Arg, His, Gln o Asn; d) el polinucleótido codifica un polipéptido MET10 de SEC ID Nº: 7, en el que X en la posición 662 es lisina; e) el polinucleótido comparte al menos el 95% de identidad de secuencias con una secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID Nº: 1; f) se produce un producto de fermentación que tiene niveles no detectables de H2S; g) la célula de levadura es una célula de Saccharomyces cerevisiae; h) el medio de fermentación está seleccionado del grupo que consiste en: un mosto de fruta y un mosto de grano; o i) el medio de fermentación es un mosto de fruta de zumo de uva.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que la célula de levadura es una cepa de levadura de vino seleccionada del grupo que consiste en: Prise de Mousse, Premier Cuveé, French Red, Montrachet, Lallemand Kl, Bordeaux, UCD522, UCD940, Ba25, Ba126, Ba137, Ba220, Bb23, Bb25, Ba30, Bb32, Bb19 y Bb22.

4. Un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido MET10 que no cataliza la conversión de sulfito en sulfuro, en el que el aminoácido en la posición 662 del polipéptido MET10 es Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Val, Trp o Tyr (SEC ID Nº: 5) , y en el que el polinucleótido está operativamente ligado a una secuencia de control de la expresión.

5. El vector de expresión de la reivindicación 4, en el que el polinucleótido:

a) codifica un polipéptido MET10 de SEC ID Nº: 34, en el que X en la posición 662 es Lys, Arg, His, Gln, Asn, Glu, Asp, Ile, Leu, Val, Phe, Tyr o Trp; b) codifica un polipéptido MET10 de SEC ID Nº: 6, en el que X en la posición 662 es Lys, Arg, His, Gln o Asn; c) codifica un polipéptido MET10 de SEC ID Nº: 7, en el que X en la posición 662 es lisina; o d) comparte al menos 95% de identidad de secuencias con una secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID Nº:

1.

6. Una célula huésped que comprende un vector de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 4 y 5.

7. La célula huésped de la reivindicación 6, en el que la célula es una célula de levadura o es una célula de Saccharomyces cerevisiae.

8. Un medio de fermentación que comprende una célula de levadura mejorada que no produce sulfuro de hidrógeno que comprende un polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido MET10 que no cataliza la conversión de sulfito en sulfuro, en el que el aminoácido en la posición 662 del polipéptido MET10 es Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Val, Trp o Tyr (SEC ID Nº: 5) , en el que una célula parental de la célula de levadura mejorada produce sulfuro de hidrógeno.

9. El medio de fermentación que comprende una célula de levadura de la reivindicación 8, en el que:

a) el polinucleótido codifica un polipéptido MET10 de SEC ID Nº: 34, en el que X en la posición 662 es Lys, Arg, His, Gln, Asn, Glu, Asp, Ile, Leu, Val, Phe, Tyr o Trp; b) el polinucleótido codifica un polipéptido MET10 de SEC ID Nº: 6, en el que X en la posición 662 es Lys, Arg, His, Gln o Asn; c) el polinucleótido codifica un polipéptido MET10 de SEC ID Nº: 7, en el que X en la posición 662 es lisina; d) el polinucleótido comparte al menos el 95% de identidad de secuencias con una secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID Nº: 1; e) la célula de levadura es una célula de Saccharomyces cerevisiae; o f) la célula de levadura es una cepa de levadura de vino seleccionada del grupo que consiste en: Prise de Mousse, Premier Cuveé, French Red, Montrachet, Lallemand Kl, Bordeaux, UCD522, UCD940, Ba25, Ba126,

Ba137, Ba220, Bb23, Bb25, Ba30, Bb32, Bb19 y Bb22.

10. Un medio de fermentación que comprende un cultivo de células de levadura mejoradas que produce niveles reducidos de sulfuro de hidrógeno que comprende una población de células de levadura, comprendiendo las células de levadura un polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido MET10 que no cataliza la conversión de sulfito en sulfuro, en el que el aminoácido en la posición 662 del polipéptido MET10 es Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Val, Trp o Tyr (SEC ID Nº: 5) , en el que el cultivo de células de levadura mejoradas produce sulfuro de hidrógeno reducido en comparación con un cultivo de células parentales.

11. El medio de fermentación que comprende un cultivo de células de levadura de la reivindicación 10, en el que:

a) el cultivo no produce niveles detectables de sulfuro de hidrógeno; b) el polinucleótido codifica un polipéptido MET10 de SEC ID Nº: 34, en el que X en la posición 662 es Lys, Arg, His, Gln, Asn, Glu, Asp, Ile, Leu, Val, Phe, Tyr o Trp; c) el polinucleótido codifica un polipéptido MET10 de SEC ID Nº: 6, en el que X en la posición 662 es Lys, Arg, His, Gln o Asn; d) el polinucleótido codifica un polipéptido MET10 de SEC ID Nº: 7, en el que X en la posición 662 es lisina; e) el polinucleótido comparte al menos el 95% de identidad de secuencias con una secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID Nº: 1; f) la población de células de levadura comprende células de Saccharomyces cerevisiae; o g) la población de células de levadura es de una cepa de levadura de vino seleccionada del grupo que consiste en: Prise de Mousse, Premier Cuveé, French Red, Montrachet, Lallemand Kl, Bordeaux, UCD522, UCD940, Ba25, Ba126, Ba137, Ba220, Bb23, Bb25, Ba30, Bb32, Bb19 y Bb22.

12. Un procedimiento de producción de una célula de levadura mejorada que produce niveles reducidos de sulfuro de hidrógeno, procedimiento que comprende sustituir un polinucleótido endógeno que codifica un polipéptido MET10 activo para sulfuro con un polinucleótido que codifica un polipéptido MET10 inactivo para sulfuro introduciendo en un padre de la célula de levadura un polinucleótido que codifica un polipéptido MET10 inactivo para sulfuro que no cataliza la conversión de sulfito en sulfuro, en el que el aminoácido en la posición 662 del polipéptido MET10 inactivo para sulfuro es Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Val, Trp o Tyr (SEC ID Nº: 5) , en el que el padre de la célula de levadura mejorada produce sulfuro de hidrógeno.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que:

a) el polinucleótido que codifica el polipéptido MET10 inactivo para sulfuro se introduce recombinantemente; b) el polinucleótido que codifica el polipéptido MET10 inactivo para sulfuro se introduce por retrocruzamiento; c) la célula de levadura mejorada no produce niveles detectables de sulfuro de hidrógeno; d) el polinucleótido codifica un polipéptido MET10 de SEC ID Nº: 34, en el que X en la posición 662 es Lys, Arg, His, Gln, Asn, Glu, Asp, Ile, Leu, Val, Phe, Tyr o Trp; e) el polinucleótido codifica un polipéptido MET10 de SEC ID Nº: 6, en el que X en la posición 662 es Lys, Arg, His, Gln o Asn; f) el polinucleótido codifica un polipéptido MET10 de SEC ID Nº: 7, en el que X en la posición 662 es lisina; g) el polinucleótido comparte al menos el 95% de identidad de secuencias con una secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID Nº: 1; h) la célula de levadura mejorada comprende células de Saccharomyces cerevisiae; o i) la célula de levadura mejorada es de una cepa de levadura de vino seleccionada del grupo que consiste en: Prise de Mousse, Premier Cuveé, French Red, Montrachet, Lallemand Kl, Bordeaux, UCD522, UCD940, Ba25, Ba126, Ba137, Ba220, Bb23, Bb25, Ba30, Bb32, Bb19 y Bb22.

Figura 4

Apilamiento: Comparación de secuencias de aminoácidos de la proteína MET10 en las cepas S288C, UCD932 y 5 UCD950.

MSF: 1036 Tipo: P Comprobación: 6465 ..

Nombre: S288C Longitud: 1036 Comprobación: 9124 Peso: 0 10 Nombre: UCD932 Longitud: 1036 Comprobación: 8702 Peso: 0

Nombre: UCD950 Longitud: 1036 Comprobación: 8639 Peso: 0