COMPOSICION Y MEDIOS DE CULTIVO QUE COMPRENDEN HIALURONA Y UN ÁCIDO GRASO ESENCIAL POLIINSATURADO SELECCIONADO DE ENTRE ÁCIDO LINOLEICO Y ÁCIDO DOCOSAHEXAENOICO.

Composición y medios de cultivo que comprenden hialurona y un ácido graso esencial poliinsaturado seleccionado de entre ácido linoleico y ácido docosahexaenoico.

Composición que comprende hialurona en un rango de concentración de 0,1 a 0,4 mg/mL y un ácido graso esencial poliinsaturado que se selecciona de entre ácido linoleico

(LA) en una concentración de entre 0,03 mM y 0,1 mM y ácido docosahexaenoico (DHA) en una concentración de entre 0,03 mM y 0,1 mM, y sus usos para generar células de calidad, tanto para la producción de animales transgénicos, para la producción animal, como para terapia celular o para reproducción asistida.

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P201231116.

Solicitante: SERVICIO ANDALUZ DE SALUD.

Nacionalidad solicitante: España.

Inventor/es: VILCHES FERRON,MIGUEL ANGEL.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen ingredientes... > A61K31/201 (teniendo uno o dos dobles enlaces, p. ej. ácidos oléico o linoléico)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales,... > C12N5/075 (Ovocitos; Ovogonias)

PDF original: ES-2443088_A1.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Composición y medios de cultivo que comprenden hialurona y un ácido graso esencial poliinsaturado seleccionado de entre ácido linoleico y ácido docosahexaenoico.

La presente invención se encuentra dentro del campo de la biología molecular, la Medicina y la Farmacia, y se refiere a una composición que permite aumentar la calidad embrionaria y la fluidez de las membranas plasmáticas, mejorando los medios que se utilizan actualmente para el cultivo celular, y especialmente para el cultivo de células madre, células madre embrionarias, y embriones, favoreciendo el adecuado desarrollo preimplantacional. Dicha composición comprende ácido linoleico (LA) , ácido docosahexaenoico (DHA) , o su combinación, y permite generar células de calidad, tanto para la producción de animales transgénicos, para la producción animal, como para terapia celular o para reproducción asistida.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

Las condiciones de cultivo in vitro pueden influenciar significativamente el desarrollo embrionario, determinando cambios responsables de su menor calidad, comparados con los embriones producidos in vivo. Durante la maduración in vitro, aproximadamente el 90% de los ovocitos inmaduros puestos a cultivar, alcanzan la metafase II y expulsan el primer cuerpo polar entre las 16 y 24 hs de comenzada la maduración. De estos, aproximadamente el 80% es fecundado y comienzan a dividirse, al menos, hasta el estadio de 2 a 4 células. Sin embargo, sólo un 25-40% alcanza el estadio de blastocisto (B) o blastocisto expandido (Bex) luego del cultivo durante 6-7 días. Esto indica que el cultivo embrionario, correspondiente al paso más prolongado dentro del proceso de producción in vitro, es el período en el que se establece el mayor porcentaje de pérdidas del sistema. A su vez, durante esta etapa, se define en gran medida la calidad de los embriones obtenidos (Enrigh et al., 2000. Theriogenology 54, 659-673, Rizos et al., 2002. Mol Reprod Dev 61, 234-248, Galli et al., 2003. Theriogenology 59, 599-616, Lonergan et al., 2003, Reproduction 126, 337–346. Lonergan et al., 2004. Biol Reprod 71, 1096-1100) .

Los medios de cultivo empleados en los inicios de la medicina reproductiva eran los mismos que se utilizaban para el cultivo de células somáticas. Se trataba fundamentalmente de soluciones salinas básicas, que con el tiempo fueron evolucionando hacia composiciones cada vez más complejas. No fue hasta mediados de los años 80 que aparecieron los primeros medios de cultivo diseñados específicamente para el cultivo de embriones. Los medios convencionales no tenían en cuenta la naturaleza dinámica del metabolismo del embrión durante su desarrollo. A mediados de los 90, surgieron los denominados medios secuenciales, cada uno de ellos diseñado para cubrir las necesidades metabólicas y nutricionales del embrión en cada fase de desarrollo.

Los parámetros que afectan a los medios de cultivo, y especialmente a los medios de cultivo embrionario son fundamentalmente: parámetros biofísicos y elementos inorgánicos. Varios autores (Menezo & Khatchadourian 1991. Assist Reprod Rev 6, 136-143) coinciden en que los parámetros biofísicos y los elementos inorgánicos más importantes a controlar en los medios de cultivo embrionario son los siguientes: Osmolaridad, pH, CO2, O2, sales minerales (fundamentalmente los niveles de sodio y de potasio asi como de magnesio, calcio, bicarbonatos, sulfatos, y fosfatos) . El agua es el componente que participa en mayor proporción en la formulación de cualquier medio de cultivo y su grado de pureza está fuertemente relacionado con el desarrollo embrionario (Marquant-Leguienne & Humblot 1998. Theriogenology 49, 3-11) . Actualmente, existe una gran cantidad de información, no siempre coincidente, referida al efecto de ciertas hormonas, factores de crecimiento y compuestos macromoleculares, sobre el desarrollo embrionario. Sin embargo, dos componentes son constantes en las formulaciones finales de los medios de cultivo utilizados corrientemente en la producción in vitro de embriones. Estos son la fuente de energía y fuente de proteína.

La fluidez de la membrana plasmática está controlada por la composición de sus ácidos grasos y por su contenido en esteroles. Sin embargo, con respecto a los lípidos, poco se sabe acerca de la importancia que tendrían en la producción de energía durante el desarrollo embrionario temprano (Thompson et al., 2000. Anim Reprod Sci 60-61, 263-275 ) . Sin embargo, en los últimos años se ha debatido la posibilidad de mejorar la viabilidad de los embriones criopreservados a través de la adición de ciertos componentes lipídicos a los medios de cultivo, específicamente ácidos grasos poilinsaturados (como el ácido linoleico) no como fuente energética, sino como fluidificador de las membranas plasmáticas (Imai et al., 1997.Theriogenology 47, 347, Hochi et al., 1999. Theriogenology 52, 497504) . Algunos estudios (Ryan et al.; 1992. J Anim Sci 70:3505-3513, Zeron et al., 2001. Reproduction 121: 447454) , han evidenciado que no existe un efecto positivo de la suplementación grasa sobre la calidad de los embriones recuperados de novillas superovuladas con FSH, aunque también se ha mencionado que la suplementación con ácidos grasos poliinsaturados puede alterar las propiedades físicas de las membrana plasmática del embrión permitiendo mejores condiciones para su desarrollo durante el periodo previo a la implantación.

Se ha encontrado que el desarrollo in vitro de ovocitos colectados de ovejas que no recibieron suplementación grasa era superior en invierno, cuando estos tenían 2.2 veces más ácidos grasos poliinsaturados en la membrana plasmática, que en el verano (Zeron et al., 2001. Reproduction 121: 447-454) . Otros estudios sugieren que la presencia de un doble enlace en la cadena de carbonos que forma los ácidos grasos puede tener

una influencia sobre las propiedades físicas de las membranas (Decker et al., 1984. J. Cell BioL 99:1398-1404) . Igualmente otros investigadores (Crowe et al., 1989. Cr y obiology 26: 76-84) sugieren que un incremento en la insaturación de los ácidos grasos en las membranas plasmáticas, está asociado con una alta fluidez de las membranas, facilitando el intercambio de nutrientes y metabolitos necesarios para el desarrollo del ovocito y del mismo embrión (Zeron et al., 2001. Reproduction 121: 447-454) . Los embriones producidos in vitro presentan una alta sensibilidad a los procesos de criopreservación (Leibo & Loskutoff 1993. Theriogenology 39: 81-94, Pollard & Leibo 1994. Theriogenology 41, 107-112) , siendo las diferencias morfológicas y/o metabólicas observadas respecto a los obtenidos in vivo las que parecerían ser las responsables (Massip et al., 1995. Hum Reprod 10, 3004-3011) . Leibo y Loskutoff determinaron que la densidad de los embriones producidos in vitro es menor que la de los obtenidos in vivo, y concluyeron que esto se debería a una mayor relación de lípidos: proteínas en el caso de los primeros.

Actualmente no es posible cultivar los embriones de mamíferos en condiciones in vitro mucho más allá de la fase de blastocito avanzado (en los seres humanos hasta el día 8 o 9 días de desarrollo) , sin perder su identidad como un embrión y su potencial en el desarrollo posterior para formar un feto, sin embargo, los embriones o células embrionarias cultivadas durante largos períodos de tiempo in vitro tienen la capacidad de dividirse y crecer como poblaciones celulares de manera indefinida (Hogan et al., 1994. Science. 303:1669-1674; Fléchon et al., 1995. Placenta. 16: 643-658; van Stekelenburg-Hamers et al., 1995. Tanaka et al., 1998. Science. 282: 2072-2075. Talbot et al., 2000. Biol Reprod. 62: 235-247; Leoni et al., 2000. J Reprod Fertil 119: 309-314; Shimada et al., 2001. Placenta 22: 652-662)... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. -Una composición que comprende hialurona en un rango de concentración de 0, 1 a 0, 4 mg/mL y un ácido graso esencial poliinsaturado que se selecciona de entre ácido linoleico (LA) en una concentración de entre 0, 03 mM y 0, 1 mM y ácido docosahexaenoico (DHA) en una concentración de entre 0, 03 mM y 0, 1 mM.

2. La composición según la reivindicación anterior, que además comprende las sales en un rango aproximado de concentración que se recoge en la tabla siguiente:

SALES mM g/L

NaC.

10. 137 5.9-8.0 KCL 4.69-5.30 0.35-0.40 MgSO4 0.20-0.80 0.022-0.97 KH2PO4 0.34-0.37 0.04-0.05 CaCL2 2H2O 1.8-2.04 0.27-0.30 NaHCO.

2. 25 2.0-2.1 MgCL2 2H2O 0.48-0.49 0.08-0.10

.

3. Una composición farmacéutica que comprende la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-2. 1.

4. La composición farmacéutica según la reivindicación 3, que además comprende otro principio activo.

5. Un medio de cultivo que comprende la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, o una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 3-4.

2.

6. Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, de la composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 3-4, o de un medio de cultivo según la reivindicación 5, en la elaboración de un medicamento.

7. Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, de la composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 3-4, o de un medio de cultivo según la reivindicación 5, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento o el diagnóstico de una enfermedad embrionaria.

8. Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, de la composición farmacéutica según 30 cualquiera de las reivindicaciones 3-4, o de un medio de cultivo según la reivindicación 5, en la elaboración de un medicamento para el diagnóstico genético preimplantacional.

9. Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, de la composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 3-4, o de un medio de cultivo según la reivindicación 5, para el cultivo de 35 células.

10. Uso de la composición, de la composición farmacéutica, o de un medio de cultivo según la reivindicación anterior, donde las células son células madre.

11. Uso de la composición, de la composición farmacéutica, o de un medio de cultivo según la reivindicación 10, donde las células madre son células madre embrionarias no humanas.

12. Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, de la composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 3-4, o de un medio de cultivo según la reivindicación 5, para el cultivo de 45 embriones.

13. Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, de la composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 3-4, o de un medio de cultivo según la reivindicación 5, para el cultivo de embriones no humanos.

5.

14. Uso de la composición, de la composición farmacéutica, o de un medio de cultivo según cualquiera de las reivindicaciones 9-13, donde las células o embriones han sido previamente criopreservados.

15. Uso de la composición, de la composición farmacéutica, o de un medio de cultivo según cualquiera de las 55 reivindicaciones 9-13, donde las células o embriones han sido previamente vitrificados.