Composiciones combinadas antisentido de horquilla y métodos para modular la expresión.

Un método para regular la expresión, comprendiendo el método:

proveer a una célula un constructo de nucleótidos

, en donde dicho constructo de nucleótidos comprende:

una primera y una segunda secuencia de nucleótidos que hibridan para formar el tallo de una estructura de tallo-bucle, y

una tercera secuencia de nucleótidos dispuesta entre las primera y segunda secuencias de nucleótidos, y

sitios de empalme colocados operacionalmente y orientados de tal manera que permiten la escisión de la porción de bucle de la estructura de tallo-bucle de la porción de tallo de la estructura de tallo-bucle,

en donde las secuencias primera y segunda de nucleótidos, cuando se aparean, generan un ácido nucleico de interferencia pequeño que modula la expresión de un objetivo,

en donde la tercera secuencia de nucleótidos es de longitud suficiente para permitir que las primera y segunda secuencias de nucleótidos se apareen de manera estable una con otra, y en donde la tercera secuencia de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos antisentido capaces de modular la expresión de un objetivo a través de la supresión antisentido,

y en donde el objetivo modulado por la secuencia de nucleótidos antisentido y el objetivo modulado por el ácido nucleico de interferencia pequeño puede ser el mismo o diferente; y

cultivar dicha célula.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2008/057704.

Solicitante: BROOKHAVEN SCIENCE ASSOCIATES, LLC.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: BUILDING 475D UPTON, NY 11973-5000 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: SHANKLIN,JOHN, NGUYEN,TAM.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > A61K48/00 (Preparaciones medicinales que contienen material genético que se introduce en las células del cuerpo vivo para tratar enfermedades genéticas; Terapia génica)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/11 (Fragmentos de ADN o de ARN; sus formas modificadas (ADN o ARN no empleado en tecnología de recombinación C07H 21/00))

PDF original: ES-2538217_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Composiciones combinadas antisentido de horquilla y métodos para modular la expresión.

Antecedentes La supresión antisentido se refiere al enlazamiento de una cadena "antisentido" de un ácido nucleico a un gen o ARNm, previniendo de esta manera la expresión del gen o la traducción del ARNm. Típicamente, para la supresión 5 antisentido, está diseñado un casete de expresión para expresar una molécula de ARN complementaria a todo o parte de un ARNm que codifica un objetivo. La sobreexpresión de la molécula ARN antisentido puede dar como resultado una expresión reducida del gen nativo.

El polinucleótido para uso en la supresión antisentido puede corresponder a todo o parte del complemento de la secuencia que codifica el objetivo, la totalidad o parte del complemento de la 5' y/o 3' región no traducida del 10 transcripto objetivo, y/o la totalidad o parte del complemento de tanto la secuencia de codificación como de las regiones no traducidas de un transcripto que codifica el objetivo. Además, el polinucleótido antisentido puede ser totalmente complementario (esto es, 100% idéntico al complemento de la secuencia objetivo) o parcialmente complementario (esto es, menos del 100% idéntico al complemento de la secuencia objetivo) a la secuencia objetivo. La supresión antisentido puede utilizarse para inhibir la expresión de múltiples proteínas en la misma célula 15 u organismo, como se describe, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos Nº 5, 952, 657. Adicionalmente, porciones de los nucleótidos antisentido pueden ser utilizados para interrumpir la expresión del gen objetivo. Generalmente, se pueden utilizar secuencias de al menos 50, 100, 200, 300, 500, o 550 nucleótidos. Métodos para utilizar supresión antisentido para inhibir la expresión de genes endógenos en plantas se describen, por ejemplo, en Liu et al (2002) Plant Physiol. 129:1732-1753 y Patentes de los Estados Unidos Nos. 5, 759, 829 y 5, 952, 657. La 20 eficiencia de la supresión antisentido puede ser incrementada mediante la inclusión de una región poli-dT en el casete de expresión en una posición 3' con respecto a la secuencia antisentido y 5' de la señal de poliadenilación. Véase, la Publicación de Patente de Estados Unidos Nº 20020058815.

La interferencia de ARN se refiere al proceso de silenciamiento génico postranscripcional específico para la secuencia en los animales mediado por los ARN de interferencia corto (ARNsi) (Fire et al, 1998, Nature, 391, 806; 25 Hamilton et al, 1999, Science, 286, 950-951) . El proceso correspondiente en plantas se denomina comúnmente como silenciamiento génico postranscripcional o silenciamiento de ARN, y también se conoce como sofocamiento en hongos. Se cree que el proceso de silenciamiento génico postranscripcional es un mecanismo de defensa celular conservado evolutivamente usado para evitar la expresión de genes foráneos y es comúnmente compartido por diversa flora y filum (Fire et al., 1999, Trends Genet., 15, 358) . Tal protección de expresión génica foránea puede 30 haber evolucionado en respuesta a la expresión de los ARN de cadena doble (ARNds) derivados de la infección viral o de la integración aleatoria de elementos transposón en un genoma anfitrión a través de una respuesta celular que destruye específicamente ARN de cadena sencilla o ARN genómico viral homólogos. La presencia del ARNds en células desencadena la respuesta de iARN a través de un mecanismo que aún tiene que ser caracterizado completamente. Este mecanismo parece ser diferente de la respuesta del interferón que resulta de la activación 35 mediada por ARNds de la proteína quinasa PKR y 2', 5'-oligoadenilato sintetasa dando como resultado la escisión no específica del ARNm por la ribonucleasa L.

La presencia de los ARNds largos en las células estimula la actividad de una enzima ribonucleasa III denominada como dícer. La dícer está involucrada en el procesamiento del ARNds en piezas cortas del ARNds conocido como los ARN de interferencia corto (ARNsi) (Hamilton et al, supra;. Berstein et al, 2001, Nature, 409, 363) . Los ARN de 40 interferencia corto derivados de la actividad de las dícer son típicamente de aproximadamente 21 a aproximadamente 23 nucleótidos de longitud y comprenden aproximadamente 19 pares de bases dobles (Hamilton et al., supra; Elbashir et al., 2001, Genes Dev., 15, 188) . La dícer también ha sido implicado en la escisión de los ARN temporales pequeños de 21- y 22- nucleótidos (ARNst) a partir de ARN precursor de estructura conservada que está implicado en el control de traducción (Hutvagner et al., 2001, Science, 293, 834) . La respuesta de la iARN 45 también representa un complejo de endonucleasa, comúnmente preferido como un complejo silenciador inducido por ARN (RISC) , que media la escisión de ARN de cadena sencilla que tiene secuencia complementaria a la cadena antisentido del ARNsi dúplex. La escisión del ARN objetivo tiene lugar en el medio de la región complementaria a la cadena antisentido del ARNSI dúplex (Elbashir et al., 2001, Genes Dev, 15, 188) .

La iARN ha sido estudiada en una variedad de sistemas. Fire et al., 1998, Nature, 391, 806, fueron los primeros en 50 observar la iARN en C. elegans. Bahramian and Zarbl, 1999, Molecular and Cellular Biology, 19, 274-283 y Wianny y Goetz, 1999, Nature Cell Biol., 2, 70, describen la iARN mediada por ARnds en sistemas de mamíferos. Hammond et al., 2000, Nature, 404, 293, describen la iARN en células de Drosophila transfectadas con ARnds. Elbashir et al., 2001, Nature, 411, 494, describen la iARN inducida por la introducción de dúplex de ARNs de 21 nucleótidos sintéticos en células de mamífero cultivadas incluyendo células de riñón embrionario humano y de HeLa y. Métodos 55 para utilizar la interferencia por ARNds para inhibir la expresión de genes vegetales endógenos se describen en Waterhouse et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13959-13965, Liu et al. (2002) Plant Physiol. 129:1732-1753, y WO 99/59029, WO 99/53050, WO 99/61631, y WO 00/59035.

Se han descrito métodos de iARN adicionales relacionados con la inhibición de la expresión de uno o más objetivos obtenidos por interferencia por ARN de horquilla (ANRhp) o interferencia por ARN de horquilla que contiene intrones (ARNhpi) . Estos métodos son altamente eficientes en la inhibición de la expresión de genes endógenos. Véase, Waterhouse and Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 5:29-38 y las referencias citadas allí.

Para la interferencia por ARNhp, el casete de expresión está diseñado para expresar una molécula de ARN que 5 hibrida consigo misma para formar una estructura de horquilla que comprende una región de bucle de cadena sencilla y un tallo de bases apareadas. La región del tallo de bases apareadas comprende una secuencia en sentido que corresponde a todo o parte del ARN mensajero endógeno que codifica el gen cuya expresión va a ser inhibida, y una secuencia antisentido que es total o parcialmente complementaria a la secuencia sentido. Así, la región de tallo de bases apareadas de la molécula determina generalmente la especificidad de la interferencia por ARN. Las 10 moléculas de ARNhp son altamente eficientes en la inhibición de la expresión de genes endógenos, y la interferencia por ARN que las inducen es heredada por generaciones subsecuentes. Véanse, por ejemplo, Chuang and Meyerowitz (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:5985- 5990; Stoutjesdijk et al. (2002) Plant Physiol. 129:1723-1731; y Waterhouse and Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 5:29-38. Métodos para utilizar la interferencia por ARNhp para inhibir o silenciar la expresión de genes se describen, por ejemplo, en Chuang and Meyerowitz (2000) Proc. Natl. 15 Acad. Sci. USA 97:5985- 5990; Stoutjesdijk et al. (2002) Plant Physiol. 129:1723-1731; Waterhouse and Helliwell (2003)... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para regular la expresión, comprendiendo el método:

proveer a una célula un constructo de nucleótidos, en donde dicho constructo de nucleótidos comprende:

una primera y una segunda secuencia de nucleótidos que hibridan para formar el tallo de una estructura de tallo-bucle, y 5

una tercera secuencia de nucleótidos dispuesta entre las primera y segunda secuencias de nucleótidos, y sitios de empalme colocados operacionalmente y orientados de tal manera que permiten la escisión de la porción de bucle de la estructura de tallo-bucle de la porción de tallo de la estructura de tallo-bucle, en donde las secuencias primera y segunda de nucleótidos, cuando se aparean, generan un ácido nucleico de interferencia pequeño que modula la expresión de un objetivo, 10

en donde la tercera secuencia de nucleótidos es de longitud suficiente para permitir que las primera y segunda secuencias de nucleótidos se apareen de manera estable una con otra, y en donde la tercera secuencia de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos antisentido capaces de modular la expresión de un objetivo a través de la supresión antisentido, y en donde el objetivo modulado por la secuencia de nucleótidos antisentido y el objetivo modulado por el ácido 15 nucleico de interferencia pequeño puede ser el mismo o diferente; y cultivar dicha célula.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico de interferencia pequeño que modula la expresión de un objetivo modula la expresión del objetivo a través de una ruta de la iARN.

3. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde un gen de interés enlazado 20 operativamente a un promotor está localizado en el bucle.

4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el bucle contiene más de una secuencia de nucleótidos que modula la expresión de un objetivo a través de la supresión antisentido.

5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el tallo contiene más de un par de secuencias de nucleótidos que, cuando se aparean, generan un ácido nucleico de interferencia pequeño que 25 modula la expresión de un objetivo.

6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el constructo de nucleótidos comprende un ANP.

7. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el constructo de nucleótidos está presente en un vector y está enlazado operativamente a un promotor. 30

8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el promotor es seleccionado del grupo que consiste de promotores virales, retrovirales, de mamífero, de plantas, bacterianos, constitutivos, regulables, fúngicos, de levadura, y de insectos.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 7 o la reivindicación 8, en donde el vector es seleccionado del grupo que consiste de plásmidos, cósmidos, vectores retrovirales, agrobacterium, vectores virales, vectores bacterianos, 35 vectores de levadura, vectores eucariotas, vectores de plantas, y vectores de mamíferos.

10. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la célula es seleccionada del grupo que consiste de células procariotas, eucariotas, bacterianas, de agrobacterium, de levadura, de plantas, de mamífero, y humanas.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la planta se selecciona del grupo que consiste de 40 Arabidopsis, girasol, algodón, colza, maíz, trigo, castor, palma, tabaco, cacahuete, sorgo, caña de azúcar, y soja.