Células mesenquimatosas y osteoblastos procedentes de células madre embrionarias humanas.

Un medio de cultivo para obtener osteoprogenitores y/u osteoblastos a partir de células madre embrionarias humanas

(hES) o su progenie, que comprende BMP4, dexametasona y ácido ascórbico o uno de sus análogos.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2002/020998.

Solicitante: Asterias Biotherapeutics, Inc.

Inventor/es: THIES,R. SCOTT, XU,CHUNHUI.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales,... > C12N5/10 (Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/09 (Tecnología del ADN recombinante)
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/50 (Análisis químico de material biológico, p. ej. de sangre, de orina; Investigación o análisis por métodos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas con grupos coordinadores; Investigación o análisis inmunológico (procedimientos de medida, de investigación o análisis diferentes de los procedimientos inmunológicos en los que intervienen enzimas o microorganismos, composiciones o papeles reactivos a este efecto; procedimientos para preparar estas composiciones, procedimientos de control sensibles a las condiciones del medio en los procedimientos microbiológicos o enzimáticos C12Q))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/02 (en los que intervienen microorganismos vivos)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PROCEDIMIENTOS O APARATOS PARA ESTERILIZAR MATERIALES... > A61L27/00 (Materiales para prótesis o para revestimiento de prótesis (prótesis dentales A61C 13/00; forma o estructura de las prótesis A61F 2/00; empleo de preparaciones para la fabricación de dientes artificiales A61K 6/02; riñones artificiales A61M 1/14))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales,... > C12N5/02 (Propagación de células individuales o de células en suspensión; Su conservación; Medios de cultivo para este fin)
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/15 (preparaciones medicinales)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales,... > C12N5/0775 (Células madre mesenquimales; Células madre derivadas de tejido adiposo)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales,... > C12N5/077 (Células mesenquimales, p. ej. Células óseas, células cartilaginosas, Células del estroma de la médula ósea, células adiposas o células musculares)

PDF original: ES-2539105_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Células mesenquimatosas y osteoblastos procedentes de células madre embrionarias humanas CAMPO TÉCNICO

Esta invención se refiere a un medio de cultivo y un entorno de crecimiento para obtener osteoprogenitores y/u osteoblastos, utilizando condiciones de cultivo especiales y técnicas de selección.

ANTECEDENTES

La medicina regenerativa es una iniciativa nueva importante en la industria biotecnológica. Se están desarrollando métodos para producir cultivos de células especializadas cuyo uso se propone para promover la reparación tisular y la curación de enfermedades para las cuales las pautas terapéuticas previas son insatisfactorias.

Un área de interés emergente es el uso de células cultivadas para reforzar o reparar los tejidos óseos. Existen varios informes publicados de células progenitoras de osteoblastos y células madre mesenquimatosas en desarrollo.

Las patentes de los EE. UU. 5 691 175, 5 681 71 y 5 693 511 (Fundación Mayo) describen células osteoblásticas fetales humanas normales inmortalizadas que expresan un mutante sensible a la temperatura del antígeno T grande del virus del simio 4. La patente de los EE. UU. 5 972 73 (Michigan) publica composiciones de células precursoras óseas que no son hematopoyéticas y que se pueden diferenciar en osteoblastos tras la exposición a un factor de crecimiento óseo y depositan calcio en la matriz extracelular. La patente de los EE. UU. 6 2 62 (DuPuy Orthopaedics) publica el aislamiento de células precursoras óseas o de cartílago a partir de células hematopoyéticas y no hematopoyéticas y propone su uso en la regeneración del hueso y el cartílago.

La publicación de patente internacional WO 95/22611 (Michigan) publica métodos para transferir ácidos nucleicos a células óseas in situ para estimular las células progenitoras óseas. Se exploran los genes osteotrópicos y de colágeno de tipo II para su uso para promover el crecimiento, reparación y regeneración óseos en un modelo en animales. La publicación de patente internacional WO 99/39724 (Oregón) propone tratar defectos óseos con células progenitoras de osteoblastos. Las células se podrán transformar para expresar una proteína morfogenética ósea tal como BMP-2.

J.E. Aubln (J. Cell Biochem. Supl. 3/31:73, 1998) revisa el tema de las células madre óseas. Los osteoprogenitores primitivos y madre y los precursores mesenquimatosos relacionados contribuyen al reemplazo de los osteoblastos en el recambio óseo y en la curación de las fracturas. El artículo formula la hipótesis de que el fenotipo de los osteoblastos maduros es heterogéneo con subpoblaciones de osteoblastos que expresan subconjuntos de los marcadores de osteoblastos conocidos, lo que da lugar a la posibilidad de múltiples rutas de diferenciación paralelas y diferentes reservas de progenitores.

Joyner ef al. (Bone 21:1, 1997) publican la identificación y enriquecimiento de células osteoprogenitoras humanas utilizando un anticuerpo monoclonal específico de la etapa de diferenciación. Se seleccionó un anticuerpo particular por su reactividad con cultivos de médula y ubicación inmunohlstoquímlca en tejidos fetales en regiones celulares progenitoras adyacentes a las células osteoblásticas. En la inmunopreclpitación con anticuerpos inmovilizados sobre una superficie sólida, el anticuerpo seleccionó unidades formadoras de colonias estromales (CFU-F, por sus siglas en Inglés). Thles et al. (Endocrínology 13:1318, 1992) publican que la proteína 2 morfogenética ósea induce la diferenciación osteoblástlca en una línea de células estromales, e Incrementa la actividad fosfatasa alcalina de manera dependiente de la dosis sin afectar a la proliferación celular.

Llechty et al. (Nature Med. 6:1282, 2) publican que las células madre mesenquimatosas humanas (MSC, por sus siglas en Inglés) se injertan y muestran una diferenciación específica del sitio después del trasplante en el útero en ovejas. Se obtuvo una población de MSC por aspiración en la cresta ilíaca de donantes humanos normales y se trasplantó en ovejas antes del desarrollo de la competencia ¡nmunológica. Las células se Injertaron y permanecieron en múltiples tejidos durante 13 meses. El artículo publica que experimentaron diferenciación específica del sitio en condrocltos, adlpocltos, miocitos, cardiomiocltos, células estromales de médula ósea y estroma tímlco.

La patente de los EE. UU. 5 98 784 (Case Western Reserve) se refiere a la obtención de MSC humanas tomando células de médula ósea, cultivándolas en medio BGJ* con suero bovino fetal e Identificándolas utilizando un anticuerpo monoclonal. La inducción de condrocltos in vitro conlleva poner en contacto un sedimento de células empaquetadas con un agente condroinductor. La patente de los EE. UU. 5 486 359 (Osiris Therapeutics) publica el aislamiento de células madre mesenquimatosas humanas que se pueden diferenciar en hueso, cartílago, músculo o estroma medular. La publicación de patente Internacional WO 97/4137 (Osiris) propone un sistema para la regeneración y aumento de hueso utilizando células madre mesenquimatosas. Las composiciones comprenden MSC o células de médula ósea fresca con un material cerámico o biopolímero reabsorblble.

No está claro si alguna de las preparaciones celulares ejemplificadas en estas publicaciones se puede producir en cantidades suficientes para su comercialización masiva como una composición terapéutica para la reparación ósea.

Células madre pluripotentes indiferenciadas de origen embrionario

Un área diferente de investigación médica trata sobre células madre que no están dedicadas a producir una progenie de ningún linaje particular. Varios descubrimientos recientes han generado expectativas sobre líneas celulares embrionarias que podrán convertirse en una fuente de células y tejidos útiles en medicina regenerativa para una amplia variedad de afecciones degenerativas. Las células madre embrionarias se describen como pluripotentes debido a que se consideran capaces de diferenciarse en varios tipos celulares (R.A. Pedersen, Scientif. Am. 28(4):68, 1999).

Se realizó un trabajo inicial con células madre embrionarias utilizando cepas de ratón endogámico como modelo (revisado en Robertson, Meth. Cell Biol. 75:173, 1997; y Pedersen, Reprod. Fértil. Dev. 6:543, 1994). Sin embargo, comparadas con las células ES de ratón, las células pluripotentes de monos y seres humanos han mostrado ser mucho más frágiles y no responden a las mismas condiciones de cultivo. Los factores que afectan a su persistencia en el cultivo y su diferenciación posterior son considerablemente diferentes. Tan solo recientemente, se han realizado descubrimientos que permiten que las células embrionarias de primates se cultiven ex vivo.

Thomson et al. (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 92:7844, 1995) fueron los primeros en cultivar con éxito células madre embrionarias de primates, utilizando monos rhesus y titfs como modelo. Posteriormente obtuvieron líneas de células madre embrionarias humanas (hES) a partir de blastocistos humanos (Science 282:114, 1998), cocultivándolas con fibroblastos embrionarios de ratón para favorecer su mantenimiento y crecimiento. Gearhart y colaboradores obtuvieron líneas de células germinales embrionarias humanas (hEG) a partir de tejido de gónadas fetales (Shamblott et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998), también favorecidas por células alimentadoras. Tanto las células hES como las hEG tienen las características que se han buscado durante tanto tiempo de las células madre pluripotentes: son capaces de una proliferación continua in vitro sin diferenciarse, retienen un cariotipo normal y retienen la capacidad de diferenciarse para producir vahos tipos de células adultas.

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Reivindicaciones:

1. Un medio de cultivo para obtener osteoprogenitores y/u osteoblastos a partir de células madre embrionarias humanas (hES) o su progenie, que comprende BMP4, dexametasona y ácido ascórbico o uno de sus análogos.

2. El medio de cultivo de la reivindicación 1, que comprende además beta-glicerofosfato.

3. Un entorno de crecimiento que comprende un medio de cultivo de acuerdo con la reivindicación 1 o la

reivindicación 2 y una estructura de soporte.