Células huésped mejoradas y métodos de cultivo.

Método de aumento de la producción de una glicoproteína de interés en una célula huésped aislada que se hamodificado por ingeniería genética para sobreexpresar dicha glicoproteína de interés,

comprendiendo dicho métodoaumentar en dicha célula huésped la expresión de alfa 1,2-manosidasa (MAN1C1) que es nativa para dicha célulahuésped.

Células huésped mejoradas y métodos de cultivo Campo de la invención La invención se refiere a células huésped mejoradas y a métodos de cultivo que mejoran la producción de glicoproteínas.

Antecedentes de la invención Son altamente deseables métodos de aumento de la producción de proteína huésped recombinante en la industria farmacéutica y en el laboratorio de muchas maneras, incluyendo ahorros de costes, ahorros de tiempo y capacidad de fabricación. El tratamiento con butirato de sodio ha sido un método de aumento de la producción de proteína en cultivo celular en procedimientos biofarmacéuticos comerciales. Sin embargo, el beneficio derivado del aumento de los rendimientos de proteína algunas veces se compensa por los efectos secundarios tóxicos del butirato de sodio.

El butirato de sodio es un ácido graso de cadena corta que inhibe la enzima histona desacetilasa (HDAC) responsable del mantenimiento de la estructura de la cromatina en el núcleo de las células (Davie, J. Nutrition 133: 2485S-2493S, 2003) . La pérdida de actividad da como resultado una alteración en la regulación transcripcional de genes a través del proceso de acetilación y desacetilación normal de las histonas (Prasad et al., In Vitro 12: 125-132, 1976) . Se ha mostrado que el cambio en la regulación transcripcional aumenta la productividad específica de líneas celulares que producen proteínas recombinantes in vitro. Por ejemplo, se ha mostrado que el butirato de sodio aumenta la síntesis de hormona foliculoestimulante (FSH) recombinante secretada, activador del plasminógeno tisular (tPA) , eritropoyetina (EPO) y trombopoyetina (TPO) en células de ovario de hámster chino (CHO) (Sung et al.,

J. Biotechnology 112: 323-335, 2004; Hendrick et al. Cytotechnology 36: 71-83, 2001; Chung et al., J. Microbiol. Biotechnol. 11, 1087-1092, 2001; Chotigeat et al., Cytotechnology 15: 217-221, 1994; Chang et al., Free Radical Research 30: 85-91, 1999) . No está claro el mecanismo preciso responsable de estos aumentos. Se ha mostrado que el tratamiento con butirato de sodio aumenta transitoriamente los niveles de ARNm para proteína recombinante, dando como resultado aumentos en la biosíntesis de proteínas resultante (Yuan et al., J. Biol. Chem. 260: 37783783, 1985) .

Se han estudiado previamente los cambios en la expresión génica provocados por el butirato de sodio en líneas celulares implicadas en la investigación del cáncer de colon. Los estudios demostraron que el butirato de sodio altera la expresión de múltiples genes implicados en la progresión del ciclo celular, diferenciación, señalización por citocinas y apoptosis. Sin embargo, tales estudios se limitaban a un subconjunto relativamente pequeño de genes y no determinaron si los genes estaban implicados en la biosíntesis de proteínas. (Joseph et al., Oncogene 23: 63046315, 2004; Tabuchi et al., Biochem. Biophys. Research Comm. 293: 1287-1294, 2002; Iacomino et al., Biochem. Biophys. Research Comm. 285: 1280-1289, 2001; Mariadason et al., Cancer Res. 60: 4561-4572, 2000; Della Ragione et al., FEBS Letters 499, 199-204, 2001) .

La enzima alfa 1, 2 manosidasa I (MAN1C1) es una enzima implicada en el procesamiento de oligosacáridos unidos en N a glicoproteínas que se ha descrito en Tremblay et al. (Glycobiology 8: 585-595, 1998) y Gonzalez et al. (J. Biol. Chem. 274: 21375-21386, 1999) . La enzima cataliza la primera etapa de recorte de la manosa asociada con el procesamiento de estructuras oligosacáridas con alto contenido en manosa eliminando un azúcar manosa terminal del oligosacárido. La glicosilación N-terminal implica la adición y eliminación de diversos azúcares de monosacáridos en los compartimentos de tanto el retículo endoplasmático (RE) como el aparato de Golgi (Kornfeld et al., Ann. Rev. Biochem. 54: 631-664, 1985) . En el RE, la glicosilación unida a N va acompañada por el plegamiento de las glicoproteínas nacientes para dar su estructura nativa a través de interacciones con chaperonas moleculares (Ellgaard et al., Science 286: 1882-1888, 1999; Jakob et al., J. Cell Biol. 142: 1223-1233, 1998) . Este proceso se ha denominado control de calidad del RE, y si se bloquea el proceso debido a una proteína mal plegada, normalmente se produce el comienzo de la degradación asociada al RE, o ERAD, de la proteína (Ellgaard et al., Curr. Opin. Cell Biol. 13: 431-437, 2001; Sifers, Science 299: 1330-1331, 2003; Oda et al., Science 299: 1394-1397, 2003; Molinari et al., Science 299: 1397-1400, 2003; Hurtley et al., Ann. Rev. Cell Biol. 5: 277-307, 1989) . Se ha mostrado que la eliminación de un azúcar manosa terminal desde Man9 hasta Man8 por la enzima alfa 1, 2 manosidasa I (MAN1C1) afecta al comienzo de la respuesta de ERAD (Liu et al., J. Biol. Chem. 274: 5861-5867, 1999; Grinna et al. J. Biol. Chem. 255, 2255-2258, 1980) .

En vista de la toxicidad de inductores de la producción de proteína tales como butirato de sodio, existe una necesidad de otros medios de aumento de la producción global de proteínas recombinantes en cultivo celular.

El documento WO 00/65070 A2 da a conocer un método para producir una glicoproteína en el que se cultivan células huésped que expresan dicha glicoproteína en presencia de un factor que modifica el estado de crecimiento en un cultivo celular, un catión de metal divalente o un componente plasmático. Se sugiere que las células huésped

deben expresar también enzimas que proporcionan las reacciones de modificación postraduccional apropiadas, entre otras alfa-1, 2-manosidasa.

En el documento WO 2004/081201 A1, se da a conocer la expresión de una glucosidasa II mutante en combinación con alfa-1, 2-manosidasa en Trichoderma reesei. La expresión de la glucosidasa II mutante aumenta la secreción de proteínas en las células. La expresión simultánea de alfa-1, 2-manosidasa pretende proporcionar un perfil de glicosilación de tipo humano.

Ninguno de estos documentos da a conocer o sugiere que la sobreexpresión de alfa-1, 2-manosidasa en una célula huésped aumente eficazmente la cantidad de una glicoproteína que se produce en dicha célula huésped.

Sumario de la invención La presente invención se refiere a un método de aumento de la producción de una glicoproteína de interés en una célula huésped aislada que se ha modificado por ingeniería genética para sobreexpresar dicha glicoproteína de interés, comprendiendo dicho método aumentar en dicha célula huésped la expresión de alfa 1, 2-manosidasa (MAN1C1) que es nativa para dicha célula huésped.

En una realización preferida de la invención, la célula huésped usada en el método de la invención se transfecta con un vector que comprende un ácido nucleico que codifica para MAN1C1 operativamente unido a una secuencia de control de la expresión heteróloga. En otra realización preferida, la célula huésped comprende una secuencia de control de la expresión heteróloga que está operativamente unida a un ácido nucleico que codifica para MAN1C1.

En una realización preferida adicional, la célula huésped se ha transfectado con un vector que comprende un ácido nucleico que codifica para dicha glicoproteína de interés operativamente unido a una secuencia de control de la expresión heteróloga. En otra realización preferida, la célula huésped comprende una secuencia de control de la expresión heteróloga operativamente unida a un ácido nucleico que codifica para dicha glicoproteína de interés.

El método de la invención puede usarse para producir cualquier glicoproteína o proteína de interés. Preferiblemente, la glicoproteína es una molécula estimulante de la eritropoyesis, tal como eritropoyetina o darbepoetina, o análogos, variantes o derivados de la misma. En una realización preferida de la invención, la glicoproteína es la eritropoyetina de SEQ ID NO:3 o la darbepoetina de SEQ ID NO:5.

En una realización preferida adicional de la invención, la célula huésped es una célula CHO, una célula humana, una célula BHK, una célula NS/0 o una célula HT-1080.

La presente invención puede usar células huésped modificadas por ingeniería genética para sobreexpresar alfa 1, 2 manosidasa (MAN1C1) y una glicoproteína o proteína de interés. Tales células huésped pueden comprender una secuencia de control de la expresión heteróloga operativamente unida a un ácido nucleico que codifica para MAN1C1, y una secuencia de control de la expresión heteróloga operativamente unida a un ácido nucleico que codifica para tal glicoproteína. La células huésped pueden modificarse por ingeniería genética para sobreexpresar cualquiera de o tanto MAN1C1 como la glicoproteína de interés mediante cualquier medio conocido en la técnica, incluyendo transfección con un... [Seguir leyendo]

1. Método de aumento de la producción de una glicoproteína de interés en una célula huésped aislada que se ha modificado por ingeniería genética para sobreexpresar dicha glicoproteína de interés, comprendiendo dicho método aumentar en dicha célula huésped la expresión de alfa 1, 2-manosidasa (MAN1C1) que es nativa para dicha célula huésped.

2. Método según la reivindicación 1, en el que dicha célula huésped se transfecta con un vector que comprende un ácido nucleico que codifica para MAN1C1 operativamente unido a una secuencia de control de la expresión heteróloga.

3. Método según la reivindicación 1, en el que dicha célula huésped comprende una secuencia de control de la 10 expresión heteróloga operativamente unida a un ácido nucleico que codifica para MAN1C1.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicha célula huésped se ha transfectado con un vector que comprende un ácido nucleico que codifica para dicha glicoproteína de interés operativamente unida a una secuencia de control de la expresión heteróloga.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicha célula huésped comprende una secuencia

de control de la expresión heteróloga operativamente unida a un ácido nucleico que codifica para dicha glicoproteína de interés.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la glicoproteína de interés es una molécula estimulante de la eritropoyesis.

7. Método según la reivindicación 6, en el que la glicoproteína de interés es eritropoyetina de SEQ ID NO: 3.

8. Método según la reivindicación 6, en el que la glicoproteína de interés es darbepoetina de SEQ ID NO: 5.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que dicha célula huésped es una célula CHO.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que dicha célula huésped es una célula humana.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que dicha célula huésped es una célula BHK.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que dicha célula huésped es una célula NS/0. 25 13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que dicha célula huésped es una célula HT-1080.