Método para la amplificación de ADN en una célula.

Un proceso para amplificar ADN, que comprende:

preparar una célula recombinante que comprende cualquiera de los polinucleótidos seleccionados del grupo que consiste en los siguientes

(A) a (E) y una unidad de ADN dispuesta en el genoma celular, en donde la unidad de ADN tiene un tamaño de 22 a 154 kb y al menos comprende un primer fragmento de ADN seleccionado del grupo que consiste en los siguientes (F) a (H), un gen diana y un segundo fragmento de ADN seleccionado de los siguientes (I) a (K),

el gen diana o polinucleótido es exógeno al huésped,

cultivar la célula recombinante en condiciones adecuadas para producir la amplificación génica para amplificar la unidad de ADN,

(A) un polinucleótido que codifica una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1,

(B) un polinucleótido que codifica una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene la deleción, sustitución, inserción o adición de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y que es funcionalmente equivalente a esa que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1,

(C) un polinucleótido que codifica una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del 90% o más respecto a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, y que es funcionalmente equivalente a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1,

(D) un polinucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2,

(E) un polinucleótido que hibrida con el polinucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 en condiciones rigurosas, y que codifica una proteína funcionalmente equivalente a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1,

(F) ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3,

(G) ADN que hibrida con el ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3 en condiciones rigurosas, y

(H) ADN que tiene una identidad del 90% o más respecto a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3,

(I) ADN representado por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 4,

(J) ADN que hibrida con el ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 4 en condiciones rigurosas, y

(K) ADN que tiene una identidad del 90% o más respecto a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 4.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/JP2009/060320.

Solicitante: MEIJI SEIKA PHARMA Co., LTD.

Inventor/es: MURAKAMI, TAKESHI, YANAI,Koji, SUMIDA NAOMI.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/09 (Tecnología del ADN recombinante)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > C12N15/00 (Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que... > C12N1/21 (modificados por la introducción de material genético extraño)

PDF original: ES-2534239_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Método para la amplificación de ADN en una célula Referencia de solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud de patente japonesa No. 28-147927 presentada el 5 de junio, 28.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un proceso para amplificar ADN útil para obtener un microorganismo que produce una sustancia objetivo en un alto rendimiento en un periodo de tiempo corto.

Antecedentes de la invención

Las cepas de alta producción usadas para la industria de la fermentación se obtienen por selección repetida y mejoras de reproducción durante varias décadas junto con procesos de mutación para obtener una buena cepa que tiene variaciones genéticas especiales. Por tanto, estos mutantes de alta producción son indudablemente el salvavidas de empresas y se consideran como los productos intensivos de técnicas muy importantes. Sin embargo, la mejora de las cepas por el proceso de mutación tiene defectos tales como que requiere mucho trabajo y tiempo, mala reproducibilidad, y baja probabilidad de obtener buenas cepas. Por tanto, la mejora de cepas recientemente ha avanzado cada vez más con la tecnología de manipulación génica como una tecnología teórica reproducible.

Los procesos para mejorar la productividad de una sustancia objetivo incluyen el aumento del número de copias por célula de un gen relacionado con la biosíntesis de la sustancia para aumentar su cantidad de expresión. La biosíntesis de metabolitos secundarios tal como antibióticos requiere muchos genes, que forman un complejo en un cromosoma que tiene una longitud que se extiende hasta varias decenas de kb. En este caso, el desarrollo de la tecnología para aumentar el número de copias de genes del complejo entero producirá muchos logros. Un proceso para aumentar el número de copias de genes relacionados con la biosíntesis de una sustancia objetivo incluye clonar en un plásmido que puede retener un alto número de copias, pero los plásmidos de tipo alta copia tienen un defecto de mantener la estabilidad, lo que hace difícil clonar ADN de una región larga. Además, los vectores cósmidos y vectores BAC que se han desarrollado para el fin de clonar el ADN de región larga están actualmente limitados en el número de copias para mejorar la estabilidad.

Se ha descrito en la patente en EE UU No. 524858 que una cierta región génica se puede amplificar en tándem en el cromosoma en Streotomvces achromoaenes. Sin embargo, esta tecnología se describe solo como una técnica que puede amplificar la región de ADN cuyo tamaño es 1 kb o menos y podría no ser aplicada a la amplificación en tándem de regiones génicas de tamaño gigante en un genoma.

Por otra parte, se ha descrito que un complejo génico biosintético de kanamicina se ha clonado por primera vez en 22 (Publicación accesible al público de la patente japonesa No. 24-173537). Se ha descrito además en el análisis génico de cepas de alta producción de kanamicina usadas en la industria de la fermentación que el número de copias del complejo génico biosintético de kanamicina se ha aumentado (Yanai, K. & Murakami, T., Journal of Antibiotics, (Japón), 24, Vol. 57, p. 351-354). Se ha revelado entonces que la unidad de amplificación que contiene el complejo génico biosintético de kanamicina tiene un tamaño de 145 kb en una cepa de alta producción de kanamicina, y la unidad de amplificación se ha amplificado a 36 o más copias (Yanai, K. et al., Proceedings ofthe National Academy of Sciences ofthe United States of America, (USA), 26, Vol. 13, p. 9661-9666). Sin embargo, la cepa de alta producción que muestra estos fenómenos es la obtenida como resultado de procesos de mutación durante un periodo largo de tiempo y selecciones repetidas para mejorar la productividad de kanamicina (Yanai, K. et al., Proceedings ofthe National Academy of Sciences ofthe United States of America, (USA), 26, Vol. 13, p. 9661-9666). Por tanto, se ha creído imposible reproducir el fenómeno de amplificación en una región de ADN de tamaño gigante encontrada en una cepa de alta producción de kanamicina y encontrar un gen clave relacionado con ella.

Se ha descrito el uso de un complejo génico de los genes biosintéticos de la síntesis de kanamicina en vectores de expresión heterólogos (Laxmi Prasad Thapa at al., Applied Microbiology and Biotechnology, vol. 76, no. 6, 28 de Julio de 27). Además, se han descrito vectores de expresión que comprenden genes de un complejo génico biosintético, por ejemplo, kanamicina (documento WO 25/95591 A2).

En base a los antecedentes descritos anteriormente, todavía existe una necesidad para un proceso para amplificar en tándem una región de ADN de tamaño gigante en un genoma que pueda ser aplicable a un complejo génico requerido para la biosíntesis de metabolitos secundarios tal como antibióticos.

Compendio de la invención

Los inventores presentes han encontrado ahora que una región de ADN de un tamaño gigante se puede amplificar eficazmente en presencia de un polinucleótido que codifica una proteína específica en células. La presente invención se basa en tal información.

Por tanto, el objeto de la presente invención es proporcionar un proceso para amplificar la región de ADN de un tamaño gigante eficazmente en células.

Según la presente invención se proporciona un proceso para amplificar ADN como se reivindica en la reivindicación 1 posteriormente.

La presente invención proporciona un proceso para amplificar ADN que comprende:

preparar una célula recombinante que comprende cualquiera de los polinucleótidos seleccionados del grupo que consiste en los siguientes (A) a (E) y una unidad de ADN dispuesta en un genoma celular,

en donde la unidad de ADN tiene un tamaño de 22 a 154 kb y al menos comprende un primer fragmento de ADN seleccionado del grupo que consiste en los siguientes (F) a (H), un gen diana y un segundo fragmento de ADN seleccionado de los siguientes (I) a (K),

el gen diana o el polinucleótido es exógeno a un huésped,

cultivar la célula recombinante en condiciones adecuadas para producir la amplificación génica para amplificar la unidad de ADN:

(A) un polinucleótido que codifica una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1,

(B) un polinucleótido que codifica una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene la deleción, sustitución, inserción o adición de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y que es funcionalmente equivalente a esa que consiste en la secuencia de aminoácidos de

SEQ ID NO: 1,

(C) un polinucleótido que codifica una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del 9% o más respecto a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, y que es funcionalmente equivalente a esa que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1,

(D) un polinucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2,

(E) un polinucleótido que híbrida con el polinucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 en condiciones rigurosas, y que codifica una proteína funcionalmente equivalente a esa que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1,

(F) ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3,

(G) ADN que híbrida con el ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3 en condiciones rigurosas,

(H) ADN que tiene una identidad del 9% o más respecto a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3,

(I) ADN representado por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 4,

(J) ADN que híbrida con el ADN que consiste en la... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

Un proceso para amplificar ADN, que comprende:

preparar una célula recombinante que comprende cualquiera de los polinucleótidos seleccionados del grupo que consiste en los siguientes (A) a (E) y una unidad de ADN dispuesta en el genoma celular,

en donde la unidad de ADN tiene un tamaño de 22 a 154 kb y al menos comprende un primer fragmento de ADN seleccionado del grupo que consiste en los siguientes (F) a (H), un gen diana y un segundo fragmento de ADN seleccionado de los siguientes (I) a (K), el gen diana o polinucleótido es exógeno al huésped,

cultivar la célula recombinante en condiciones adecuadas para producirla amplificación génica para amplificar la unidad de ADN,

(A) un polinucleótido que codifica una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:

1,

(B) un polinucleótido que codifica una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene la deleción, sustitución, inserción o adición de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y que es funcionalmente equivalente a esa que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1,

(C) un polinucleótido que codifica una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del 9% o más respecto a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, y que es funcionalmente equivalente a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1,

(D) un polinucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2,

(E) un polinucleótido que híbrida con el polinucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 en condiciones rigurosas, y que codifica una proteína funcionalmente equivalente a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1,

(F) ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3,

(G) ADN que híbrida con el ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3 en condiciones rigurosas, y

(H) ADN que tiene una identidad del 9% o más respecto a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3,

(I) ADN representado por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 4,

(J) ADN que híbrida con el ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 4 en condiciones rigurosas, y

(K) ADN que tiene una identidad del 9% o más respecto a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 4.

El proceso según la reivindicación 1, en donde la unidad de ADN comprende en orden desde el extremo 5 el primer fragmento de ADN, el gen diana y el segundo fragmento de ADN.

El proceso según la reivindicación 1, en donde el gen diana consiste en un complejo génico biosintético de antibióticos.

El proceso según la reivindicación 1, en donde la unidad de ADN comprende además un gen de resistencia a un fármaco.

El proceso según la reivindicación 1, en donde el polinucleótido es ADN y está dispuesto en el genoma de la célula recombinante.

El proceso según la reivindicación 1, en donde el huésped es una cepa productora de antibiótico.

Una célula recombinante, en donde se introducen múltiples copias de la unidad de ADN en un genoma por el proceso según la reivindicación 1.

La célula recombinante según la reivindicación 7, en donde el gen diana es exógeno a un huésped.

Uso de una composición para amplificar ADN por el proceso según la reivindicación 1, la composición comprende una proteína seleccionada de:

1) una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1,

2) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una deleción, sustitución, inserción o adición de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, que es funcionalmente equivalente a la que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, y

3) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del 9% o más respecto a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, que es funcionalmente equivalente a la que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

1. Uso de un vector para amplificar ADN por el proceso según la reivindicación 1, el vector comprende un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en (A) a (C) en una forma operativa:

(A) un polinucleótido que codifica una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1,

(B) un polinucleótido que codifica una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una deleción, sustitución, inserción o adición de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, y que es funcionalmente equivalente a la que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, y

(C) un polinucleótido que codifica una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del 9% o más respecto a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, y que es funcionalmente equivalente a la que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

11. Uso de un vector para amplificar ADN por el proceso según la reivindicación 1, el vector comprende una unidad de ADN que tiene un tamaño de 22 a 154 kb y al menos comprende un primer fragmento de ADN seleccionado del grupo que consiste en los siguientes (F) a (H), un gen diana y un segundo fragmento de ADN seleccionado del grupo que consiste en los siguientes (I) a (K), y el vector que es capaz de introducir la unidad de ADN en un genoma celular:

(F) ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3,

(G) ADN que híbrida con el ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3 en condiciones rigurosas, y

(H) ADN que tiene una identidad del 9% o más respecto a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3,

(I) ADN representado por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 4,

(J) ADN que híbrida con el ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 4 en condiciones rigurosas, y

(K) ADN que tiene una identidad del 9% o más respecto a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 4.

12. El proceso según la reivindicación 1, en donde la unidad de ADN es exógena al huésped.