Métodos y composiciones para modular la actividad de células tumorales.

Un anticuerpo que se une específicamente a un sitio entre los aminoácidos 421 a 443 de una porción C-terminal de una subunidad β

de clusterina humana para uso en el tratamiento de cáncer mediante la modulación de la actividad de células de carcinoma, que comprende inhibir transiciones epiteliales a mesenquimatosas en las células de carcinoma.

detallada de la Invención

La clusterlna se ha Identificado como diana potenclalmente Interesante para estrategias terapéuticas (Cervellera et al., 2000, J Biol Chemistry, vol. 275, n° 28, p. 21055-21060; July et al., 2002, Prostate, vol. 50, n° 3, p. 179-188; Trougakos et al., 2005, Free Radical Biology and Medicine, vol. 38, n° 4, p.436-449), y se han identificado anticuerpos antl-clusterlna específicos, por ejemplo por Spagnoli et al. (documento WO 2005080434), o incluso están comerclalmente disponibles, por ejemplo por Santa Cruz Biotechnology Inc. desde 1999 - "Clusterin-alpha (C- 18): sc-6419".

Sin embargo, por primera vez se ha descrito aquí que la clusterina es una diana terapéutica cuya inhibición bloquea EMT sin evitar la acción supresora de tumores antiproliferativa de la TGF-p. La clusterina se identificó en primer lugar como una proteína implicada posiblemente en EMT usando análisis transcriptómico, y después se analizó para identificar sitios de unión potenciales en clusterina. En consecuencia, se crearon péptidos sintéticos, y se produjeron o adquirieron preparaciones de anticuerpos dirigidas contra estos péptidos. Adicionalmente, se aislaron doce anticuerpos monoclonales usando como antígeno clusterina recombinante de longitud completa. Se confirmó que tanto las preparaciones de anticuerpos anti-péptidos como los doce anticuerpos monoclonales se unen a clusterina recombinante. Se mostró que las preparaciones de anticuerpos policlonales anti-péptidos y cinco de los doce anticuerpos monoclonales inhiben EMT. Se mostró que estos cinco anticuerpos monoclonales neutralizantes interactúan con el mismo epítopo peptídico que los anticuerpos anti-péptidos.

Usando RT-PCR semicuantitativa, análisis de transferencia Western y análisis de microscopía inmunofluorescente, se confirmó que varios de los cambios transcripcionales asociados a EMT que se detectaron mediante análisis de micromatrices se reflejaron en cambios en el mensaje y la abundancia de proteína (clusterina y caveolina, como se muestra en la Fig. 3). Los anticuerpos anti-péptidos se usaron para demostrar que clusterina es un mediador esencial de la EMT que no está implicado en rutas inhibidoras del crecimiento mediadas por TGF-p (Figs. 4-6). Estos resultados indican que la clusterina es una diana terapéutica accesible cuya inhibición bloquea EMT sin evitar la acción supresora de tumores anti-proliferativa de la TGF-p.

El epítopo en la clusterina que es importante para la generación de agentes inhibidores de EMT se elucidó usando preparaciones de anticuerpos anti-péptidos en ensayos de neutralización. Se usaron dos preparaciones de anticuerpos policlonales comerciales diferentes dirigidos contra péptidos sintéticos que corresponden a las secciones del término C de la subunidad p de clusterina. El primer anticuerpo (de RDI Research Diagnostics Inc.) se dirigió contra el péptido sintético que corresponde a los aminoácidos 421-437 de clusterina (VEVSRKNPKF METVAEK, SEC ID NO 1) (denominado RDI), y el segundo anticuerpo (de Santa Cruz Biotechnology Inc.) se dirigió contra el péptido sintético que corresponde a los aminoácidos 432-443 de clusterina (ETVAEKALQ EYR, SEC ID NO 2) (denominado C-18). También se adquirió un anticuerpo monoclonal anti-péptido (denominado B5) contra el mismo péptido (SEC ID NO 2). A continuación se muestra el solapamiento entre estos dos epítopos. La capacidad de estas preparaciones de anticuerpos para bloquear EMT indica la importancia de la porción C-terminal de la subunidad p de clusterina a la hora de inducir EMT (Fig. 4-6, que muestra los resultados de C-18; se obtienen resultados similares con RDI).

rs

LTQGED QYYLRVTTVA SHTSDSDVPS GVTEVVVKLF DSDPtTVÍVP

Predicción de subdominios funcionales putativos en clusterina en base a bioinformática estructural

Generalmente, se piensa que la clusterina es una proteína que está solo parcialmente estructurada, que contiene fragmentos de glóbulos fundidos. Adlclonalmente, se ha clasificado como una proteína intrínsecamente desordenada. Se postula que la clusterina contiene varias clases independientes de sitios de unión capaces de ¡nteractuarcon otras parejas de unión numerosas.

La secuencia de clusterina se ha examinado usando programas de bioinformática, a saber:

* PredlctProteln(Rost, 1996).

GenTHREADER (Jones, 1999).

COILS (Lupas, 1996).

PONDR(L¡etal.,1999)

El fragmento C-termlnal de la subunidad p se identificó como una región de unión putativa. El fragmento (a.a. 375- 449, SEC ID NO.: 4), que comienza después de la segunda región de espiral enrollada, está probablemente desplegado pero tiene cierta tendencia a la formación de lámina p.

Se produjo un péptldo sintético que corresponde a a.a. 421-437 de clusterina, a fin de generar preparaciones de anticuerpos policlonales en BRI que son similares a la preparación de anticuerpo 1 comercial (RDI) (estas nuevas preparaciones policlonales se denominan pAb#9 y #10). Adicionalmente, clusterina humana de longitud completa se expresó en células 293 y se purificó a fin de usarla como antígeno para generar anticuerpos monoclonales frente a clusterina humana de longitud completa. Se crearon doce anticuerpos monoclonales contra clusterina de longitud completa, y se demostró mediante ELISA que interactúan con clusterina. Estos doce anticuerpos se denominan 6E12, 7B7, 21B12, 20G3, 20E11, 18F4, 16C11, 16B5, 11E2, 8F6, 7D6, 7C12.

Se confirmó que las preparaciones de anticuerpos policlonales creadas contra el epítopo de a.a. 421-437 (pAb#9 y

#10) inhiben la EMT(Fig. 8).

Se confirmó que las doce preparaciones de anticuerpos monoclonales creadas contra clusterina humana de longitud completa interactúan con clusterina humana recombinante, según se evidencia por su capacidad para inmunoprecipitar clusterina (Fig. 9A). Se mostró que cinco de los doce anticuerpos monoclonales son capaces de neutralizar la acción promotora de EMT de la clusterina en el ensayo de movilidad celular de tinta negra (Fig. 9B) y en el ensayo de movilidad celular de curación de heridas (no mostrado). Los cinco anticuerpos monoclonales neutralizantes son 11E2, 21B12, 20E11, 16C11, 16B5.

Se usaron dos ensayos de calcografiado epitópico con biosensores a base de resonancia de plasmones de superficie (SPR) (Fig. 10) para determinar si los cinco anticuerpos monoclonales neutralizantes generados usando clusterina de longitud completa ¡nteractuaron con el mismo epítopo peptídico de clusterina que las preparaciones de anticuerpos anti-péptidos.

A continuación se describen los dos enfoques que se usaron:

1) Los anticuerpos monoclonales se capturaron individualmente en una superficie de matriz de sensor CM5 en la que se inmovilizó covalentemente un anticuerpo de conejo anti-Fc de ratón (cuando se capturó, el mAb se denominó mAb1 en este enfoque experimental). Entonces se dejó que la clusterina se uniese a mAb1. Entonces se inyectaron secuencialmente los cinco anticuerpos monoclonales sobre clusterina unida a mAb1 (el mAb Inyectado se denominó mAb2 en este enfoque experimental), a fin de determinar si tanto mAb1 como mAb2 son capaces de ¡nteractuar simultáneamente con clusterina (Fig. 11). Se encontró que los cinco mAbs neutralizantes (excepto 20E11 en algunos casos) compitieron entre sí por la unión a clusterina (cuando se usó tanto mAb1 como mAb2). Adicionalmente, se encontró que compiten con los anticuerpos anti-péptidos C18, pAb#10 y B5, sugiriendo que los cinco mAbs neutralizantes interactúan con los epítopos peptídlcos solapantes de pAb#10, pAbC18 y mAb B5. Se debería observar que, aunque parece que Ab 20E11 tiene en algunos casos un epítopo distinto (cuando se usa como mAb1 o como mAb2), esta conclusión no estaba apoyada por los resultados del segundo enfoque experimental.

2) Los anticuerpos monoclonales se inmovilizaron individualmente de forma covalente sobre una superficie de matriz de sensor CM5 usando acoplamiento de aminas (cuando se inmovilizó, el mAb se denominó mAb1 en

44!

VEYSRKKPKF METVAEK J 'J i \ HKKHREE

Anticuerpo 1

Anticuerpo 2

este enfoque experimental). Para demostrar la competición por la unión a clusterina, se incubó entonces un Ab (denominado Ab2 en este enfoque) con clusterina antes de la inyección del complejo sobre la superficie de mAb1 (Fig. 11). Se confirmó que los cinco mAbs neutralizantes compitieron entre sí por la unión a clusterina, y con los anticuerpos anti-péptidos C18, pAb#10 y B5. Esto confirma que los cinco mAbs neutralizantes ¡nteractúan con los epítopos peptídicos solapantes de pAb#10, pAbC18 y mAb B5.

Se secuenciaron las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) hipervariables de los... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo que se une específicamente a un sitio entre los aminoácidos 421 a 443 de una porción C-terminal de una subunidad p de clusterina humana para uso en el tratamiento de cáncer mediante la modulación de la actividad de células de carcinoma, que comprende inhibir transiciones epiteliales a mesenquimatosas en las células de carcinoma.

2. El anticuerpo para el uso según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es monoclonal o pollclonal.

3. El anticuerpo para el uso según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo tiene una secuencia de aminoácidos que comprende SEC ID NO.:6.

4. El anticuerpo para el uso según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende una o más de SEC ID NO.:8, SEC ID NO.:9, SEC ID NO.:10, SEC ID NO.:11, SEC ID NO.:12, SEC ID NO.:20, SEC ID NO.:21, SEC ID NO.:22, SEC ID-NO. 23 o SEC ID NO.:24.

5. El anticuerpo para el uso según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal que comprende una secuencia de aminoácidos que corresponde a una o más regiones determinantes de la complementariedad de SEC ID NO.:8, SEC ID NO.:9, SEC ID NO.:10, SEC ID NO.:11, SEC ID NO.:12, SEC ID NO.:20, SEC ID NO.:21, SEC ID NO.:22, SEC ID NO.:23 o SEC ID NO.:24.

6. Un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a clusterina y que comprende una combinación seleccionada de:

a. Una región variable de cadena ligera como se define en SEC ID NO.:8 o SEC ID NO.:9, y una región variable de cadena pesada como se define en SEC ID NO.:20;

b. Una región variable de cadena ligera como se define en SEC ID NO.:10, y una región variable de cadena pesada como se define en SEC ID NO.:21;

c. Una región variable de cadena ligera como se define en SEC ID NO.:11, y una región variable de cadena pesada como se define en SEC ID NO.:22;

d. Una región variable de cadena ligera como se define en SEC ID NO.:12, y una región variable de cadena pesada como se define en SEC ID NO.:23;

e. Una región variable de cadena ligera que comprende tres regiones determinantes de la

complementariedad de SEC ID NO.:8 o SEC ID NO.:9, y una región variable de cadena pesada que comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de SEC ID NO.:20;

f. Una región variable de cadena ligera que comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de SEC ID NO.:10, y una región variable de cadena pesada que comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de SEC ID NO.:21;

g. Una región variable de cadena ligera que comprende tres regiones determinantes de la

complementariedad de SEC ID NO.:11, y una región variable de cadena pesada que comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de SEC ID NO.:22;

h. Una región variable de cadena ligera que comprende tres regiones determinantes de la

complementariedad de SEC ID NO.:12, y una región variable de cadena pesada que comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de SEC ID NO.:23;

i. Una región variable de cadena ligera que comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de SEC ID NO.:8 o SEC ID NO.:9, y una región variable de cadena pesada que comprende una CDR1 seleccionada del grupo que consiste en GYSFTGYN, GYTFTDYS, y GYTFTNYG, una CDR2 seleccionada del grupo que consiste en IDPYYGTP, INTETGEP, INTYTGEP, IDPYNGDT y una CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos ALNSLLRLNAMDY;

j. Una región variable de cadena ligera que comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de SEC ID NO.:10, y una región variable de cadena pesada que comprende una CDR1 seleccionada del grupo que consiste en GYSFTGYN, GYTFTDYS, y GYTFTNYG, una CDR2 seleccionada del grupo que consiste en IDPYYGTP, INTETGEP, INTYTGEP y una CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos ARTGSSGYFDC; o

k. Una región variable de cadena ligera que comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de SEC ID NO.:11, y una región variable de cadena pesada que comprende una CDR1 seleccionada del grupo que consiste en GYSFTGYN, GYTFTDYS, y GYTFTNYG, una CDR2 seleccionada del grupo que consiste en IDPYYGTP, INTETGEP, INTYTGEP y una CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos

ARDGFLYFFDY.

7. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 6, en el que la unión del anticuerpo a clusterina inhibe la transición epitelial a mesenquimatosa en células de carcinoma.

8. Una vacuna para tratar carcinomas, que comprende la inhibición de la transición epitelial a mesenquimatosa, que comprende un vehículo farmacéuticamente adecuado y un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en SEO ID NO.:4 o una porción de SEC ID NO.:4 que comprende SEC ID NO.:1, SEC ID NO.:2 o los aminoácidos 431 a 443 de una porción C-terminal de una subunidad p de clusterina humana, acoplado a una proteína portadora.

9. La vacuna según la reivindicación 8, en la que la secuencia de aminoácidos consiste en SEC ID NO.:1, SEC ID NO.:2, o los aminoácidos 421 a 443 de una porción C-terminal de una subunidad p de clusterina humana.

10. Uso de un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en o que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con SEC ID NO.:1, SEC ID NO.:2, SEC ID NO.:4, o una porción de SEC ID NO.:4 que comprende SEC ID NO.:1, SEC ID NO.:2 o aminoácidos 421 a 443 de una porción C-terminal de una subunidad p de clusterina humana, para preparar una vacuna para inhibir transiciones epiteliales a mesenquimatosas en células de carcinoma para tratar carcinoma, en el que dicho péptido está acoplado a una proteína portadora.

11. El uso según la reivindicación 10, en el que la secuencia de aminoácidos consiste en SEC ID NO.:4, SEC ID NO.:1, SEC ID NO.:2, o aminoácidos 421 a 443 de una porción C-terminal de una subunidad p de clusterina humana.

12. Una molécula de ácido nucleico que codifica un aminoácido que consiste en SEC ID NO.:1, SEC ID NO.:2, SEC ID NO.:4, o los aminoácidos 421-443 de una porción C-terminal de una subunidad p de clusterina humana, para tratar carcinomas, que comprenden la inhibición de la transición epitelial a mesenquimatosa.

13. Una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno que se une específicamente a clusterina y que comprende una combinación seleccionada de:

a. Una región variable de cadena ligera como se define en SEC ID NO.:8 o SEC ID NO.:9, y una región variable de cadena pesada como se define en SEC ID NO.:20;

b. Una región variable de cadena ligera como se define en SEC ID NO.:10, y una región variable de cadena pesada como se define en SEC ID NO.:21;

c. Una región variable de cadena ligera como se define en SEC ID NO.:11, y una región variable de cadena pesada como se define en SEC ID NO.:22;

d. Una región variable de cadena ligera como se define en SEC ID NO.:12, y una región variable de cadena pesada como se define en SEC ID NO.:23;

e. Una región variable de cadena ligera que comprende tres regiones determinantes de la

complementariedad de SEC ID NO.:8 o SEC ID NO.:9, y una región variable de cadena pesada que comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de SEC ID NO.:20;

f. Una región variable de cadena ligera que comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de SEC ID NO.:10, y una región variable de cadena pesada que comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de SEC ID NO.:21;

g. Una reglón variable de cadena ligera que comprende tres regiones determinantes de la

complementariedad de SEC ID NO.:11, y una región variable de cadena pesada que comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de SEC ID NO.:22;

h. Una reglón variable de cadena ligera que comprende tres regiones determinantes de la

complementariedad de SEC ID NO.:12, y una región variable de cadena pesada que comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de SEC ID NO.:23;

i. Una región variable de cadena ligera que comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de SEC ID NO.:8 o SEC ID NO.:9, y una región variable de cadena pesada que comprende una CDR1 seleccionada del grupo que consiste en GYSFTGYN, GYTFTDYS, y GYTFTNYG, una CDR2 seleccionada del grupo que consiste en IDPYYGTP, INTETGEP, INTYTGEP y una CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos ALNSLLRLNAMDY;

j. Una región variable de cadena ligera que comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de SEC ID NO.:10, y una región variable de cadena pesada que comprende una CDR1 seleccionada del grupo que consiste en GYSFTGYN, GYTFTDYS, y GYTFTNYG, una CDR2 seleccionada del grupo que consiste en IDPYYGTP, INTETGEP, INTYTGEP y una CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos

ARTGSSGYFDC;o

k. Una región variable de cadena ligera que comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de SEC ID NO.:11, y una reglón variable de cadena pesada que comprende una CDR1 seleccionada del grupo que consiste en GYSFTGYN, GYTFTDYS, y GYTFTNYG, una CDR2 seleccionada del grupo que consiste en IDPYYGTP, INTETGEP, INTYTGEP y una CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos ARDGFLYFFDY.

14. El anticuerpo para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el anticuerpo comprende una combinación seleccionada del grupo que consiste en:

a. Una región variable de cadena ligera como se define en SEC ID NO.:8 o SEC ID NO.:9, y una región variable de cadena pesada como se define en SEC ID NO.:20;

b. Una región variable de cadena ligera como se define en SEC ID NO.:10, y una región variable de cadena pesada como se define en SEC ID NO.:21;

c. Una región variable de cadena ligera como se define en SEC ID NO.:11, y una región variable de cadena pesada como se define en SEC ID NO.:22;

d. Una región variable de cadena ligera como se define en SEC ID NO.:12, y una región variable de cadena pesada como se define en SEC ID NO.:23;

e. Una región variable de cadena ligera que comprende tres regiones determinantes de la

complementariedad de SEC ID NO.:8 o SEC ID NO.:9, y una región variable de cadena pesada que comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de SEC ID NO.:20;

f. Una región variable de cadena ligera que comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de SEC ID NO.:10, y una región variable de cadena pesada que comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de SEC ID NO.:21;

g. Una región variable de cadena ligera que comprende tres regiones determinantes de la

complementariedad de SEC ID NO.:11, y una región variable de cadena pesada que comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de SEC ID NO.:22;

h. Una región variable de cadena ligera que comprende tres regiones determinantes de la

complementariedad de SEC ID NO.:12, y una región variable de cadena pesada que comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de SEC ID NO.:23;

i. Una región variable de cadena ligera que comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de SEC ID NO.:8 o SEC ID NO.:9, y una región variable de cadena pesada que comprende una CDR1 seleccionada del grupo que consiste en GYSFTGYN, GYTFTDYS, y GYTFTNYG, una CDR2 seleccionada del grupo que consiste en IDPYYGTP, INTETGEP, INTYTGEP y una CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos ALNSLLRLNAMDY;

j. Una región variable de cadena ligera que comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de SEC ID NO.:10, y una región variable de cadena pesada que comprende una CDR1 seleccionada del grupo que consiste en GYSFTGYN, GYTFTDYS, y GYTFTNYG, una CDR2 seleccionada del grupo que consiste en IDPYYGTP, INTETGEP, INTYTGEP y una CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos

ARTGSSGYFDC; o

k. Una región variable de cadena ligera que comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de SEC ID NO.:11, y una región variable de cadena pesada que comprende una CDR1 seleccionada del grupo que consiste en GYSFTGYN, GYTFTDYS, y GYTFTNYG, una CDR2 seleccionada del grupo que consiste en IDPYYGTP, INTETGEP, INTYTGEP y una CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos ARDGFLYFFDY.

15. El anticuerpo 21B12, en el que el anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera como se define en SEC ID NO.:11, y una región variable de cadena pesada como se define en SEC ID NO.:22.

16. El anticuerpo 16B5, en el que el anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera como se define en SEC ID NO.:12, y una región variable de cadena pesada como se define en SEC ID NO.:23.

17. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 6, 7, 15 ó 16, para uso en el tratamiento de carcinoma, con lo que dicho anticuerpo inhibe transiciones epiteliales a mesenquimatosas en células de carcinoma, uniéndose específicamente el anticuerpo a un sitio entre los aminoácidos 421 y 443 de una porción C-terminal de una subunidad p de clusterina humana.

18. Una composición que comprende el anticuerpo para uso según las reivindicaciones 1 a 5, o 17, y un diluyente

farmacéuticamente adecuado.

19. La composición según la reivindicación 18, que comprende el anticuerpo para uso, en la que el anticuerpo se usa para dirigir agentes que tienen actividad antitumoral hacia células tumorales.

20. Una célula aislada que expresa el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 6, 7, 15 ó 16.

5 21. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 10, 11, o 14 a 16, en el que las células de carcinoma son

células de carcinoma de mama o células de carcinoma de próstata.

22. El anticuerpo para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o 17, en el que las células de carcinoma son células de carcinoma de mama o células de carcinoma de próstata.

23. Uso de un anticuerpo, que se une específicamente a un sitio entre los aminoácidos 421 y 443 de una porción C- 10 terminal de una subunidad p de clusterina humana, para detectar transición epitelial a mesenquimatosa en células

de carcinoma.