Procedimiento para la obtención de un extracto peptídico con capacidad antioxidante a partir de semillas de aceituna.

Procedimiento para obtener péptidos con capacidad antioxidante mediante digestión enzimática de las proteínas aisladas a partir de la semilla de aceituna.

El procedimiento consiste en extraer las proteínas de la semilla de la aceituna empleando un método desarrollado previamente, disolver el aislado de proteínas en un medio tamponado a pH ligeramente alcalino, digerir con la enzima alcalasa, centrifugar y recoger el sobrenadante que contiene los péptidos con capacidad antioxidante in vitro.

PROCEDIMIENTO PARA LA OBTENCIÓN DE UN EXTRACTO PEPTÍDICO CON CAPACIDAD ANTIOXIDANTE A PARTIR DE SEMILLAS DE ACEITUNA

La presente invención se refiere a un procedimiento químico para obtener un extracto peptídico con capacidad antioxidante a partir de un asilado de proteínas de semilla de aceituna mediante el empleo de la enzima proteolítica alcalasa.

SECTOR DE LA TÉCNICA

Esta invención permite obtener sustancias con elevado valor añadido a partir de la semilla contenida en el hueso de la aceituna que constituye un residuo generado en el procesamiento de la aceituna. El interés de la invención está en el tratamiento de residuos industriales mediante la obtención de compuestos de alto valor biológico y en la aplicación de los péptidos bioactivos obtenidos. El tratamiento de residuos industriales y la obtención de compuestos de alto valor biológico es de interés para el sector químico y la industria manufacturera de aceituna de mesa y aceite de oliva mientras que, desde el punto de vista de la aplicación de los péptidos encontrados, esta invención iría dirigida al sector alimentario y farmacéutico.

ESTADO DE LA TÉCNICA

En los procesos de producción de aceitunas de mesa y aceite de oliva se produce un gran volumen de residuos, lo que constituye un problema medioambiental y económico. Concretamente, el hueso de la aceituna forma parte de este material residual que, en general, no se suele aprovechar. Sin embargo, la semilla contenida en el hueso de la aceituna presenta un alto contenido en proteínas, que llegan a representar el 20% del peso, y de donde podrían extraerse moléculas con alto valor añadido como son péptidos bioactivos [1, 2], Un gran número de hidrolizados proteicos derivados de la hidrólisis enzimática de proteínas de plantas y sus subproductos han demostrado tener capacidad antioxidante [3], El consumo de antioxidantes se ha relacionado inversamente con el envejecimiento, la muerte celular, la diabetes y el cáncer [4], Además, los compuestos antioxidantes son también muy útiles en el control de la oxidación lipídica en productos alimentarios. La oxidación lipídica es un grave problema en la industria alimentaria dado que da lugar a la aparición de malos sabores y olores, colores oscuros y productos de reacción

potencialmente tóxicos. La demanda de antioxidantes naturales ha aumentado en los últimos años debido a que son más seguros que los antioxidantes sintéticos y a que el consumidor tiene una percepción negativa de estos últimos. El uso de estos antioxidantes naturales ha sido estudiado en buena medida para la prevención de la oxidación lipídica en alimentos [5, 6],

En esta patente se propone una alternativa para el aprovechamiento y revalorización de este material residual.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

El procedimiento químico propuesto permite la obtención de un extracto peptídico con capacidad antioxidante a partir de semilla de aceituna.

El procedimiento requiere la extracción previa de las proteínas a partir de la semilla de la aceituna, siguiendo un método previamente optimizado, y la hidrólisis enzimática de las proteínas extraídas. La extracción de las proteínas contenidas en el hueso de la aceituna se realiza utilizando un tampón Tris-HCI a pH 7,5 que contiene dodecilsulfato sódico y ditiotreitol y precipitando las proteínas solubilizadas con acetona. Las proteínas aisladas se disuelven en un medio alcalino y se lleva a cabo la hidrólisis utilizando la enzima alcalasa a una temperatura controlada y con agitación. Una vez finalizada la digestión, se inactiva la enzima y se separa por centrifugación el sobrenadante que contiene los péptidos con capacidad antioxidante.

A continuación, en la Tabla 1 se muestran los resultados de la evaluación de la capacidad antioxidante para el extracto peptídico obtenido mediante la digestión con alcalasa de las proteínas contenidas en la semilla de aceitunas de la variedad Arbequina.

Tabla 1. Capacidad antioxidante del extracto peptídico obtenido por la digestión de las proteínas de la semilla de la aceituna con la enzima alcalasa.

Muestra

Capacidad de Capacidad de captura de captura de Valor radicales DPPH radicales ABTS TEACa

Capacidad de captura de radicales hidroxilo (%)

la oxidación de lípidos (%)

Inhibición de

(%)

(%)

a El valor TEAC (actividad antioxidante en equivalentes de Trolox) se expresa como micromoles de equivalentes de Trolox por gramos de muestra. b Usando GSH (1 mg/mL) como control positivo.

0 Usando Trolox (1 mM) como control positivo.

La comparación de los resultados con los obtenidos para un compuesto control con reconocida capacidad antioxidante demuestra que los hidrolizados obtenidos constituyen interesantes fuentes de péptidos con propiedades antioxidantes.

A través de este procedimiento se describe una alternativa de aprovechamiento de un material residual como son los huesos de aceituna y que hasta ahora no se realizaba. En comparación con otras formas de aprovechamiento de este residuo, el procedimiento que aquí se presenta permite la revalorización de esta fuente barata de proteínas.

Por último, el procedimiento objeto de la invención es sencillo, económico, rápido y seguro, ya que utiliza instrumentación básica y una enzima comercial de uso extendido en la industria alimentaria.

MODO DE REALIZACIÓN

Obtención del aislado de proteína de la semilla de aceituna

Para la obtención del aislado proteico de la semilla de la aceituna se emplea un método optimizado previamente [7], Brevemente, el hueso de la aceituna se deja secar a temperatura ambiente y se extrae del mismo la semilla mediante fractura mediante procedimientos mecánicos. Una vez extraída la semilla de la aceituna esta se tritura en un molinillo. Las proteínas de la semilla se extraen empleando un medio de extracción formado por un tampón Tris-HCI 125 mM (pH 7,5) que contiene dodecilsulfato de sodio y ditiotreitol. En estas condiciones las proteínas pasan a la disolución acuosa y el residuo sólido se elimina mediante centrifugación. Se recupera el sobrenadante y se le añade acetona

previamente enfriada para precipitar las proteínas. El aislado proteico se recoge por centrifugación de la muestra y se deja secar a temperatura ambiente.

Obtención del hidmlizado de proteínas de la semilla de aceituna

La hidrólisis del extracto proteico obtenido a partir de la semilla de aceituna se lleva a cabo empleando la enzima proteolítica alcalasa. Para ello, el aislado proteico de la semilla de aceituna se disuelve en una disolución reguladora adecuada, como puede ser un tampón fosfato a baja concentración, a un pH comprendido entre 7,0 y 9,0. Se recomienda una concentración de enzima de 0,01-0,5 U/g proteína. La reacción de hidrólisis se llevan a cabo a una temperatura comprendida entre 40-60 °C durante un tiempo suficientemente elevado como para que la digestión sea completa (superior a 1 h)y con agitación. Seguidamente, se realiza la inactivación de la enzima, que se sugiere que se lleve a cabo calentando las muestras a una temperatura superior a 100 °C. A continuación, se centrifugan las muestras para precipitar las posibles proteínas remanentes. La capacidad antioxidante del extracto peptídico obtenido se evalúa a continuación.

Evaluación de la capacidad antioxidante

La capacidad antioxidante del hidrolizado obtenido con la enzima alcalasa se evaluó empleando cuatro métodos in vitro distintos: ensayo ABTS (ácido 2,2-azino-bis(3- etilbenzotiazolin-6-sulfónico)), ensayo DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazilo), ensayo del radical hidroxilo y ensayo de autooxidanción del ácido linoleico.

El ensayo ABTS se realiza de acuerdo a lo descrito por Wiriyaphan y col. [8] con algunas modificaciones. Se prepara una disolución stock de ABTS0+ mezclando, a temperatura ambiente y en oscuridad durante 16 h, una disolución de ABTS 7,4 mM con persulfato potásico 2,5 mM. El radical ABTS0+ formado se diluye con tampón fosfato 10 mM (pH 7,4) hasta obtener una absorbancia de 0,7 ± 0,01 a 734 nm. A 1 ^L de muestra se le añaden 100 ^L de la disolución de ABTS0+ y la absorbancia se mide transcurridos 6 min. Se calcula la capacidad antioxidante de acuerdo a la siguiente ecuación:

Capacidad de captura... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la obtención de un extracto peptídico con capacidad antioxidante a partir de semillas de aceituna caracterizado por las etapas de aislamiento de las proteínas de la semilla, digestión enzimática de las mismas y centrifugación.

2. Procedimiento para la obtención de un extracto peptídico con capacidad antioxidante, según las reivindicaciones 1, caracterizado porque las proteínas aisladas se disuelven en una disolución reguladora a pHs entre 7,0 y 9,0.

3. Procedimiento para la obtención de un extracto peptídico con capacidad antioxidante, según las reivindicaciones 1, caracterizado porque la digestión enzimática de las proteínas se realiza utilizando la enzima proteolítica alcalasa.

4. Procedimiento para la obtención de un extracto peptídico con capacidad antioxidante, según las reivindicación 3, caracterizado porque la digestión enzimática de las proteínas requiere una concentración de enzima alcalasa comprendida entre 0,01 y 0,5 g enzima/g proteína.

5. Procedimiento para la obtención de un extracto peptídico con capacidad antioxidante, según la reivindicación 3, caracterizado porque la digestión enzimática de las proteínas tiene lugar a temperaturas comprendidas entre 40 y 60 °C.

6. Procedimiento para la obtención de un extracto peptídico con capacidad antioxidante, según la reivindicación 3, caracterizado porque la digestión enzimática de las proteínas se realiza en un tiempo suficiente que asegure el máximo grado de hidrólisis (tiempo de digestión superior a 1 h).

7. Procedimiento para la obtención de un extracto peptídico con capacidad antioxidante, según la reivindicación 3, caracterizado porque finalizada la digestión es necesario la inactivación de la enzima.

8. Procedimiento para la obtención de un extracto peptídico con capacidad antioxidante, según la reivindicación 1, caracterizado porque se centrifuga la muestra digerida para separar el sobrenadante que contiene péptidos con capacidad antioxidante.

OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

ESPAÑA

N.° solicitud:

Fecha de presentación de la solicitud: 18.02.2013 Fecha de prioridad:

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

© Intel.: C12P21/06 (2006.01)

DOCUMENTOS RELEVANTES

Categoría

Documentos citados

Reivindicaciones

afectadas

ZHENBAO, Z. et al. Production and characterization of angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitory peptides from apricot (Prunus armeniaca L.) kernel protein hydrolysate. EUROPEAN FOOD RESEARCH AND TECHNOLOGY. Mayo 2010, Vol. 231, N° 1, páginas 13-19, todo el documento.

UDENIGWE, C.C. et al. Antioxidant and angiotensin converting enzyme-inhibitory properties of flaxseed protein-derived high Fisher ratio peptide mixture. JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY. 28.04.2010. Vol. 58, n° 8, páginas 4762-4768, todo el documento.

YUST, MdM. et al. Hypocholesterolaemic and antioxidant activities of chickpea (Cicer arietinum L.) protein hydrolysates. J. SCI. FOOD AGRIC. 01.07.2012. Vol. 92, N°. 9, páginas 1994-2001, todo el documento.

WANG, W. et al. Characterization of seed storage proteins and their synthesis during seed development in olea europaea". 2001. INT. J. DEV. BIOL. Vol. 45, N° S1, páginas S63-S64, todo el documento.

ZEB, A. et al. Olive (Olea europea L.) seeds, from chemlstry to health beneflts. NUTS AND SEEDS IN HEALTH AND DESEASE PREVENTION. 2011. Edited by: Victor R. Preedy, Ronald Ross Watson and Vlnood B. Patel. ISBN: 978-0-12-375688-6. 2011 Elsevler Inc.

Páginas 847-853, todo el documento.

1-8

1-8

1-8

1-8

1-8

Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia

Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica

O: referido a divulgación no escrita

P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud

E: documento anterior, pero publicado después de la fecha