Procedimiento para la producción de Laminoácidos ramificados por fermentación de bacterias corineformes,

caracterizado porque se emplean unas bacterias corineformes, en las que se sobreexpresan los genes brnE y/o brnF, realizándose que el gen brnE codifica un polipéptido, que posee la función de una proteína exportadora para un aminoácido ramificado, y cuya secuencia de aminoácidos es idéntica a SEQ ID No. 5 por lo menos en un 90 %, y que el gen brnF codifica un polipéptido, que posee la función de una proteína exportadora para un aminoácido ramificado, y cuya secuencia de aminoácidos es idéntica a SEQ ID No. 3 por lo menos en un 90 %

Son objeto del invento unas secuencias de nucleótidos que codifican la exportación de aminoácidos ramificados, un procedimiento para su detección y su aislamiento y un procedimiento para la producción por fermentación de aminoácidos ramificados mediando utilización de bacterias corineformes, en las que son sobreexpresados unos genes que codifican la exportación de aminoácidos ramificados.

Estado de la técnica

Los aminoácidos ramificados L-isoleucina, L-valina y L-leucina encuentran utilización en la industria farmacéutica, en la medicina humana y en la nutrición de animales.

Es conocido el hecho de que ciertos aminoácidos ramificados pueden ser producidos por fermentación de cepas de bacterias corineformes, en particular de Corynebacterium glutamicum. A causa de la gran importancia, se está trabajando constantemente en el mejoramiento de los procedimientos de producción. Unos mejoramientos de los procedimientos pueden concernir a unas medidas técnicas de fermentación tales como p.ej. una agitación y un abastecimiento con oxígeno, o a la composición de los medios nutritivos, tal como p.ej. la concentración de azúcares durante la fermentación, o el tratamiento para dar la forma del producto mediante p.ej. una cromatografía con intercambio de iones o las propiedades intrínsecas de rendimiento del microorganismo propiamente dicho.

Para el mejoramiento de las propiedades de rendimiento de estos microorganismos se utilizan unos métodos de mutagénesis, selección y elección de mutantes. De esta manera se obtienen unas cepas, que son resistentes frente a unos antimetabolitos tales como p.ej. el compuesto análogo a isoleucina hidroxamato de isoleucina (Kisumi M, Komatsubara S, Sugiura M, Chibata I (1972) Journal of Bacteriology 110: 761-763), el compuesto análogo a valina 2-tiazol-alanina (Tsuchida T, Yoshinanga F, Kubota K, Momose H (1975) Agricultural and Biological Chemistry, Japan 39: 1319-1322), o el compuesto análogo a leucina α-aminobutirato (Ambe-Ono Y, Sato K, Totsuka K, Yoshihara Y, Nakamori S (1996) Bioscience Biotechnology Biochemistry 60: 1386-1387), o que son auxótrofos para unos metabolitos importantes en regulación y producen aminoácidos ramificados (Tsuchida T, Yoshinaga F, Kubota K, Momose H, Okumura S (1975) Agricultural and Biological Chemistry; Nakayama K, Kitada S, Kinoshita S (1961) Journal of General and Applied Microbiology, Japan 7: 52-69; Nakayama K, Kitada S, Sato Z, Kinoshita (191) Journal General and Applied Microbiology, Japón 7: 41-51).

Desde hace algunos años se emplean asimismo unos métodos de la técnica de ADN recombinante para el mejoramiento de las cepas de Corynebacterium que producen aminoácidos ramificados, mediante el recurso de que se amplifican unos genes individuales para la biosíntesis de los aminoácidos ramificados, y se investiga la repercusión sobre la producción de aminoácidos ramificados. Unos artículos recopilativos a este respecto se encuentran, entre otras, en la cita de Kinoshita ("Glutamic Acid Bacteria" [Bacterias productoras de ácido glutámico] en: Biology of Industrial Microorganisms, Demain y Solomon (coordinadores de edición), Benjamin Cummings, Londres, Reino Unido, 1985, 115-142), Hilliger (BioTec 2, 40-44 (1991)), Eggeling (Amino Acids 6: 261-272 (1994)), Jetten y Sinskey (Critical Reviews in Biotechnology 15, 73-103 (1995)), Sahm y colaboradores (Annuals of the New York Academy of Science 782, 25-39 (1996)), y Eggeling y colaboradores, Journal of Biotechnology 56: 168-180 (1997)).

En el documento de solicitud de patente alemana DE 195 48 222 A se divulgan el gen lysE de Corynebacterium glutamicum que codifica una proteína exportadora de lisina, así como un procedimiento para la producción de aminoácidos, en particular de L-lisina.

Por Eggeling y colaboradores: "The fruits of molecular physiology: engineering the L-isoleucine biosynthesis pathway in Corynebacterium glutamicum" [Los frutos de la fisiología molecular: ingeniería genética de la ruta de biosíntesis de L-isoleucina en Corynebacterium glutamicum] Journal of Biotechnology, tomo 56, n° 3, 28 de agosto de 1997, páginas 167-182, se supone ciertamente la existencia de una exportadora de isoleucina y proponen el mejoramiento de las cepas de Corynebacterium glutamicum, que producen isoleucina, mediante aumento de la exportación de isoleucina, pero allí no se describe la proteína exportadora propiamente dicha.

Hermann T. y colaboradores: "Mechanism and Regulation of isoleucine excretion in Corynebacterium glutamicum" [Mecanismo y regulación de la excreción de isoleucina en Corynebacterium glutamicum] Applied and Environmental Microbiology, tomo 62, n° 9, septiembre de 1996, páginas 3238-3244 mencionan ciertamente que unos péptidos que contienen aminoácidos, no son catabolizados en C. glutamicum, y, por consiguiente, tienen que ser exportados para el crecimiento de la bacteria sobre un medio que contiene péptidos. Sin embargo, ellos no describen explícitamente que unas bacterias corineformes con defecto en la exportación de isoleucina, a las que se les añadieron unos péptidos que contenían isoleucina, muestran un mal crecimiento.

Misión del invento

Los autores del invento se han planteado la misión de poner a disposición unas medidas técnicas nuevas para realizar una mejorada producción por fermentación de aminoácidos ramificados.

Descripción del invento

Los aminoácidos ramificados encuentran aplicación en la industria farmacéutica, en la medicina humana y en la nutrición de animales. Por lo tanto, existe un interés general en poner a disposición unos nuevos procedimientos mejorados para la producción de aminoácidos ramificados.

Cuando en lo sucesivo se mencionen "aminoácidos ramificados", por este concepto se han de entender en particular L-isoleucina, L-valina o L-leucina.

Son objeto de la descripción unos polinucleótidos aislados, que contienen por lo menos una de las secuencias de polinucleótidos, que se escogen entre el conjunto que se compone de

a) un polinucleótido, que es idéntico por lo menos en un 70 % al polinucleótido que codifica un polipéptido, que contiene por lo menos una secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 3 o 5,

b) un polinucleótido que codifica un polipéptido, que contiene una secuencia de aminoácidos, que es idéntica por lo menos en un 70 % a una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 3 o 5,

c) un polinucleótido, que es complementario con respecto a los polinucleótidos de a) o b), y

d) un polinucleótido, que contiene por lo menos 15 bases consecutivas de las secuencias de polinucleótidos de a), b) ó c).

Es objeto de la descripción asimismo un ADN de manera preferida recombinante, replicable en microorganismos corineformes, con la procedencia de Corynebacterium, que contiene por lo menos las secuencias de nucleótidos que codifican los genes brnF y/o brnE, expuestas en la SEQ ID No. 1 y en la SEQ ID No. 6.

Es asimismo un objeto del invento un ADN replicable,

que contiene:

(i) las secuencias de nucleótidos, que se exponen en SEQ ID No. 1 o en SEQ ID No. 6 que codifican los genes brnE y/o brnF, o

(ii) por lo menos una secuencia, que corresponde a las secuencias (i) dentro del marco de la degeneración del código genético, o

(iii) por lo menos una secuencia, que se hibrida con la secuencia complementaria con respecto a las secuencias (i) o (ii), y eventualmente

(iv) unas mutaciones con sentido de función neutra en (i).

Otros objetos son

unos polinucleótidos, que contienen por lo menos una de las secuencias de nucleótidos, escogidas entre el conjunto formado por las SEQ ID No. 1, 2, 4 o 6,

unos polinucleótidos que codifican unos polipéptidos, que contienen por lo menos una de las secuencias de aminoácidos, como se exponen en SEQ ID No. 3 o 5,

un vector, que contiene el o los polinucleótido(s) de acuerdo con la reivindicación 1, o la secuencia de ADN representada en SEQ ID No. 1 o en SEQ ID No. 6,

y unas bacterias corineformes que sirven como células anfitrionas, y que contienen el vector.

Objeto del invento son, de acuerdo con las reivindicaciones 20 a 29:

Unos polinucleótidos...

1. Procedimiento para la producción de L-aminoácidos ramificados por fermentación de bacterias corineformes,

caracterizado porque

se emplean unas bacterias corineformes, en las que se sobreexpresan los genes brnE y/o brnF,

realizándose que el gen brnE codifica un polipéptido, que posee la función de una proteína exportadora para un aminoácido ramificado, y cuya secuencia de aminoácidos es idéntica a SEQ ID No. 5 por lo menos en un 90 %, y que el gen brnF codifica un polipéptido, que posee la función de una proteína exportadora para un aminoácido ramificado, y cuya secuencia de aminoácidos es idéntica a SEQ ID No. 3 por lo menos en un 90 %.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque

el gen brnE codifica un polipéptido, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 5.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado porque

el gen brnE comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 4.

4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque

el gen brnF codifica un polipéptido, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 3.

5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado porque

el gen brnF comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2.

6. Procedimiento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque

se sobreexpresan el gen brnE y el gen brnF.

7. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque

se utiliza un polinucleótido, que comprende la secuencia de nucleótidos desde la posición 101 hasta la 1176 de SEQ ID No. 1.

8. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque

en el caso de las bacterias corineformes se trata de las del género Corynebacterium.

9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado porque

en el caso de las bacterias corineformes del género Corynebacterium se trata de las de la especie Corynebacterium glutamicum.

10. Procedimiento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque

se emplean unas bacterias corineformes, que ya segregan un aminoácido ramificado.

11. Procedimiento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque

la sobreexpresión se consigue mediante la utilización de un promotor fuerte.

12. Procedimiento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque

la sobreexpresión se consigue mediante un aumento del número de copias.

13. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizado porque

el aumento del número de copias se consigue mediando utilización de un plásmido.

14. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizado porque

el aumento del número de copias se consigue mediante una amplificación en el cromosoma.

15. Procedimiento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1-14, caracterizado porque

para la producción de L-isoleucina se sobreexpresa(n) adicionalmente uno o varios de los gen(es), que se escoge(n) entre el conjunto que se compone de

a) el gen hom que codifica la homoserina deshidrogenasa o el alelo homdr que codifica una homoserina deshidrogenasa, que es resistente frente a una retroalimentación,

b) el gen ilvA que codifica la treonina deshidratasa, o el alelo ilvA(Fbr) que codifica una treonina deshidratasa, que es resistente frente a una retroalimentación,

c) los genes ilvBN que codifican la acetohidroxiácido sintetasa,

d) el gen ilvD que codifica la dihidroxiácido deshidratasa

e) el gen pyc que codifica la piruvato carboxilasa, y

f) el gen mqo que codifica la malato:quinona oxidorreductasa.

16. Procedimiento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1-14,

caracterizado porque

para la producción de L-leucina se sobreexpresa(n) adicionalmente uno o varios de los gen(es), que se escoge(n) entre el conjunto que se compone de

a) el gen leuA que codifica la isopropilmalato sintetasa, o un alelo que codifica una isopropilmalato sintetasa, que es resistente frente a una retroalimentación,

b) los genes leuC y leuD que codifican la isopropilmalato deshidratasa,

c) el gen leuB que codifica la isopropilmalato deshidrogenasa

d) los genes ilvBN que codifican la acetohidroxiácido sintetasa,

e) el gen ilvD que codifica la dihidroxiácido deshidratasa, y

f) el gen mqo que codifica la malato:quinona oxidorreductasa.

17. Procedimiento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1-14, caracterizado porque

para la producción de L-valina se sobreexpresa(n) adicionalmente uno o varios de los gen(es), que se escoge(n) entre el conjunto que se compone de

a) los genes ilvBN que codifican la acetohidroxiácido sintetasa,

b) el gen ilvD que codifica la dihidroxiácido deshidratasa, y

c) el gen mqo que codifica la malato:quinona oxidorreductasa.

18. Procedimiento de acuerdo con por lo menos una de las reivindicaciones 1-17, caracterizado porque

se llevan a cabo las siguientes etapas adicionales:

a) un enriquecimiento del L-aminoácido deseado en el medio o en las células de los microorganismos, y

b) un aislamiento del L-aminoácido.

19. Procedimiento para el aislamiento del gen brnE o brnF, caracterizado porque

como cepas indicadoras se obtienen unas mutantes de una bacteria corineforme, con defecto en este/estos gen(es) y que no crecen, o sólo crecen escasamente, sobre un medio nutritivo que contiene un oligopéptido que contiene isoleucina y/o leucina y/o valina, y

a) se identifica y aísla el gen brnE o el gen brnF después de haber establecido un banco de genes, o

b) en el caso de la mutagénesis con un transposón, se selecciona en cuanto al transposón que contiene una resistencia frente a antibióticos, y se obtienen así los genes deseados,

realizándose que el gen brnE codifica un polipéptido, que posee la función de una proteína exportadora para un aminoácido ramificado, y cuya secuencia de aminoácidos es idéntica por lo menos en un 90 % a SEQ ID No. 5, y realizándose que el gen brnF codifica un polipéptido, que posee la función de una proteína exportadora de un aminoácido ramificado, y cuya secuencia de aminoácidos es idéntica por lo menos en un 90 % a SEQ ID No. 3.

20. Polinucleótidos aislados, que se escogen entre el conjunto que se compone de

a) un polinucleótido que codifica un polipéptido, que tiene la función de una proteína exportadora para un aminoácido ramificado, y que posee la secuencia de aminoácidos que se expone en SEQ ID No. 3 o 5,

b) un polinucleótido que codifica un polipéptido, que tiene la función de una proteína exportadora para un aminoácido ramificado y que posee una secuencia de aminoácidos, que es idéntica por lo menos en un 90 % a la secuencia de aminoácidos, que se expone en SEQ ID No. 3 o 5, y

c) un polinucleótido, que es complementario con respecto a los polinucleótidos de a) o b).

21. Polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 20, con la secuencia de nucleótidos SEQ ID No. 2.

22. Polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 20 que codifica una secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 5.

23. Polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 20, con la secuencia de nucleótidos SEQ ID No. 4.

24. Polinucleótido de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 20 hasta 23, con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 o 6.

25. Vectores, que contienen un polinucleótido de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 20 hasta 24.

26. Bacterias corineformes o Escherichia coli, que contienen el vector de acuerdo con la reivindicación 25.

27. Bacterias corineformes de acuerdo con la reivindicación 26, caracterizadas porque se trata de Corynebacterium glutamicum.

28. Bacterias corineformes de acuerdo una o varias de las reivindicaciones 26 a 27, caracterizadas porque se trata de una cepa, que produce un aminoácido ramificado.

29. Cebador de oligonucleótidos o sonda de oligonucleótidos, que contiene por lo menos 15 nucleótidos consecutivos, que se escogen entre SEQ ID No. 4 o la secuencia de nucleótidos que es complementaria con respecto a ésta.