Procedimiento y kits para la detección de VPH.

Un procedimiento para la detección del virus VPH en una muestra biológica por PCR múltiplex quecomprende la siguiente etapa:

- extraer ácidos nucleicos genómicos de dicha muestra,

- amplificar simultáneamente una pluralidad de secuencias génicas con el cebador de mezcla de PCRa) 5'-CAGGGACAIAAIAATGGYATWTG-3',

b) 5'-GAAAAATAAACTGTAAATCATATT-3',

c) 5'-GAGCTGTCGCTTAATTGCTC-3',

d) 5'-IWACIGTGGAAGAAGARAC-3',

e) 5'-AGAYRTTATAITTATTCIGTRTATGG-3'

en el que dichos cebadores están marcados con una molécula seleccionada del grupo que consiste en biotina,digoxigenina, fluoresceína, de manera que se producen secuencias génicas amplificadas,

- obtener la hibridación entre dichas secuencias génicas amplificadas y las sondas específicas unidas en sitiospreseleccionados de medios de soporte sólido miniaturizado

- destacar dicha hibridación por medio de una reacción colorimétrica.

Procedimientos y kits para la detección del VPH

La invención se refiere a un sistema para investigar e identificar simultáneamente diversos agentes patógenos (bacterias, virus o parásitos) que son responsables de patologías humanas comunes y/o graves, en particular agentes patógenos que son llevados por el agua y/o alimentos tales como carne, pescado, leche, alimentos dulces o que pueden encontrarse en muestras biológicas de origen humano tales como frotis faríngeos, frotis urogenitales, aspirados bronquiales, sangre, biopsias y heces.

El sistema puede usarse además, por medio de modificaciones mínimas, para identificar rápida y simultáneamente polimorfismos y/o alteraciones genéticas que predisponen a ciertas patologías neoplásicas y/o genéticas, por ejemplo, perturbaciones en la coagulación en familias.

En los laboratorios microbiológicos, la identificación de un agente patógeno en una muestra biológica se realiza normalmente de manera directa, esto es a través del examen del cultivo de la muestra.

Un inconveniente del procedimiento anteriormente mencionado consiste en el hecho de que esto último, además de constituir un riesgo biológico potencial para los operarios designados, a menudo es laborioso, como en el caso de la investigación de micoplasmas y virus entéricos, y requiere al menos 48 horas de incubación de la muestra. Este aumento en el tiempo de trabajo produce un consiguiente aumento en los costes de análisis.

Además, el tiempo prolongado que se tarda en realizar el análisis conduce a un retraso significativo en la entrega de los respectivos resultados analíticos por un laboratorio. Esto es potencialmente perjudicial, por ejemplo, para un paciente que espera recibir el tratamiento adecuado cuando este último ha de basarse en el resultado analítico anteriormente mencionado.

Otro inconveniente consiste en el hecho de que muchos agentes patógenos humanos y animales son difíciles o imposibles de propagar en un cultivo, lo que hace que los procedimientos analíticos conocidos sean significativamente difíciles de aplicar.

Un inconveniente adicional consiste en el hecho de que a menudo los agentes patógenos que son capaces de producir síntomas clínicos similares tienen rasgos de cultivo muy diferentes, lo que hace imposible realizar una investigación simultánea de estos agentes patógenos realizando un procedimiento analítico único.

Con el fin de superar los inconvenientes de la técnica anterior se han propuesto procedimientos de análisis microbiológico que se basan en la biología molecular. Estos últimos no requieren el crecimiento del cultivo del microorganismo para obtener la identificación del mismo, ya que no se basan en el reconocimiento de características bioquímicas y/o serológicas particulares del microorganismo, sino en la identificación de secuencias específicas del gen diana que están presentes en el genoma del microorganismo. Con el fin de obtener esta identificación, es necesario por tanto conocer, al menos parcialmente, el genoma del microorganismo investigado, y esto es posible por el hecho de que existen diversas bases de datos a partir de las cuales pueden obtenerse secuencias parciales o completas de la mayor parte de agentes patógenos.

Por tanto, se han concebido procedimientos de identificación que permiten identificar secuencias diana específicas, si estas últimas están presentes en una muestra, permiten amplificar estas secuencias mediante la técnica de PCR y permiten proporcionar un resultado final (presencia/ausencia) analizando el producto amplificado por medio de electroforesis en gel de agarosa.

El documento WO03027323 describe un chip de ADN para la detección de infección por VPH e identificación del genotipo del VPH, en el que el chip de ADN comprende sondas específicas para L1. El documento WO03057914 proporciona un procedimiento in vitro de selección para la expresión de transcritos de ARNm del gen L1 y el gen E6 del virus del papiloma humano en muestras clínicas.

Sin embargo, un inconveniente asociado a los procedimientos conocidos basados en PCR consiste en el hecho de que el análisis electroforético solo no previene que estos procedimientos, a pesar de su considerable sensibilidad, proporcionen resultados erróneos, es decir, falsos positivos o falsos negativos.

Otro inconveniente asociado a los procedimientos conocidos basados en PCR es que la amplificación del ADN genómico está dirigida sólo a las regiones L1 y E6 específicas para VPH.

Un objeto de la invención es mejorar los procedimientos de análisis microbiológico conocidos.

Otro objeto es proporcionar un procedimiento analítico que permita investigar e identificar simultáneamente microorganismos patógenos que son taxonómicamente diferentes entre sí en muestras de alimentos y/o biológicas.

Otro objeto es proporcionar un procedimiento analítico que permita investigar e identificar microorganismos tales como virus entéricos y micoplasmas de una manera sustancialmente rápida, para cuyos microorganismos se conocen y se usan procedimientos significativamente largos y complicados.

Otro objeto adicional es mejorar los procedimientos analíticos de selección en el campo microbiológico.

Otro objeto adicional es proporcionar un sistema de selección para identificar agentes patógenos en muestras de alimentos y/o biológicas.

Todavía otro objeto es proporcionar un procedimiento para la interpretación de un resultado de un análisis microbiológico.

En un primer aspecto de la invención se proporciona un procedimiento para investigar e identificar agentes patógenos en una muestra que comprende:

- extraer ácidos nucleicos genómicos de dicha muestra;

- amplificar simultáneamente una pluralidad de secuencias génicas comprendidas en dichos ácidos nucleicos genómicos, de manera que se produzcan secuencias génicas amplificadas;

- obtener la hibridación entre dichas secuencias génicas amplificadas y las sondas específicas unidas a sitios preseleccionados de medios de soporte sólido miniaturizado;

- destacar dicha hibridación por medio de una reacción colorimétrica de manera que proporcione un patrón específico sobre dichos medios de soporte sólido miniaturizado.

En una forma de realización, los medios de soporte sólido miniaturizado comprenden un chip.

En un segundo aspecto de la invención se proporciona un kit analítico para investigar e identificar agentes patógenos en una muestra, que comprende medios para amplificar el gen para obtener una amplificación de las secuencias génicas específicas contenidas en los ácidos nucleicos de dichos agentes patógenos, sondas que contienen un medio de soporte sólido miniaturizado dispuestas para hibridarse con dichas secuencias génicas después de dicha amplificación, medios de puesta en relieve dispuestos para destacar dicha hibridación.

Debido a estos aspectos se ponen a disposición un procedimiento, un chip y un kit analítico que juntos constituyen un sistema de selección que permite investigar e identificar rápidamente varios agentes patógenos bacterianos y/o víricos en una misma muestra. Este sistema de selección puede usarse eficazmente para analizar muestras de alimentos potencialmente contaminadas y muestras biológicas de origen humano e investigar aquellos agentes patógenos, tales como virus entéricos y micoplasmas, para los cuales una búsqueda realizada mediante medios analíticos conocidos implica procedimientos elaborados y un gasto significativo de tiempo y dinero.

Los medios de puesta en relieve producen una reacción colorimétrica que destaca la hibridación completada de las secuencias específicas con sondas respectivas unidas a la superficie del medio de soporte sólido miniaturizado, que pueden ser el pocillo de un polichip de vidrio o el pocillo de una microplaca. Este resultado puede leerse a simple vista, si se usan chips que tienen un área > 1 cm2 (polichip) , o por medio de un escáner si se usan chips que tienen un área < 1 cm2 (microplaca) .

La posibilidad de investigar e identificar una pluralidad de microorganismos taxonómicamente distintos en una misma muestra y durante un análisis único surge del hecho de que se pueden fijar sondas específicas para agentes patógenos recíprocamente diferentes sobre la superficie de un único chip, en posiciones numerosas y preseleccionadas (direcciones) de manera que se formen patrones específicos recíprocamente diferentes. De esta forma, es posible probar simultáneamente la presencia de una amplia gama de secuencias específicas que son recíprocamente diferentes en un mismo producto amplificado y sobre un mismo chip.

A diferencia de lo que... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para la detección del virus VPH en una muestra biológica por PCR múltiplex que comprende la siguiente etapa:

- extraer ácidos nucleicos genómicos de dicha muestra,

- amplificar simultáneamente una pluralidad de secuencias génicas con el cebador de mezcla de PCR a.

5. CAGGGACAIAAIAATGGYATWTG-3', b.

5. GAAAAATAAACTGTAAATCATATT-3', c.

5. GAGCTGTCGCTTAATTGCTC-3', d.

5. IWACIGTGGAAGAAGARAC-3', e.

5. AGAYRTTATAITTATTCIGTRTATGG-3' en el que dichos cebadores están marcados con una molécula seleccionada del grupo que consiste en biotina,

digoxigenina, fluoresceína, de manera que se producen secuencias génicas amplificadas, - obtener la hibridación entre dichas secuencias génicas amplificadas y las sondas específicas unidas en sitios preseleccionados de medios de soporte sólido miniaturizado

- destacar dicha hibridación por medio de una reacción colorimétrica.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que dichas sondas comprenden todas las siguientes secuencias de ácidos nucleicos:

o Sonda de PAN VPH L1.

5. TTTGTWACTGTIGTRGAYACIACMCGIAGTAC-3',

o Sonda PAN VPH E6/E7: 5' -TGYCAIAARCCITTRTGIMIAGIRGAAAA-3'

o Sondas VPH HR E6/E7:

•

5. CGTACAGAAACCCAGGTGTAATCATGCRTG-3',

•

5. CAGTATAATCATGCAYGGTAAAGTACCAAC-3',

•

5. GTGTAATAAMGCCATGCGTGGTAATGTACCACA-3',

•

5. ACGIAGIGAAACACAIGTITATTTTTTTATGCATGGACC-3',

y en el que las sondas específicas para el subtipo del VPH están seleccionadas del grupo que consiste en las siguientes secuencias:

•

5. ATCCGTAACTACATCTTCCACATACACCAA-3',

•

5. ATCTGTGTCTAAATCTGCTACATACACTAA-3',

•

5. GTCATTATGTGCTGCCATATCTACTTCAGA-3',

•

5. TGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCA-3',

•

5. TAGTACATTATCTGCAGCATCTGCATCC-3,

•

5. TATCTGCAACAACACAAACGTTATCCAC-3'

•

5. TGTTTGTGCTGCAATTGCAAACAGTGATAC-3'

•

5. TTTATGCACACAAGTAACTAGTGACAGTAC-3',

•

5. TACACAATCCACAAGTACAAATGCACCATA-3',

• 5' -GTCTGTGTGTTCTGCTGTGCTTTCTAGTGA-3',

•

5. TCTACCTCTATAGAGTCTTCCATACCTTCT-3',

•

5. GCTGCCACACAGTCCCCCACACCAACCCCA-3',

•

5. CTGCAACATCTGGTGATACATATACAGCTG-3',

•

5. TCTACTGACCCTACTGTGCCCAGTACATAT-3',

•

5. GCCACTACACAGTCCCCTCCGTCTACATAT-3',

•

5. ACACAAAATCCTGTGCCAAGTACATATGAC-3',

•

5. AGCACTGCCACTGCTGCGGTTTCCCCAACA-3',

•

5. TGCTGAGGTTAAAAAGGAAAGCACATATAA-3',

•

5. ACTCTTTCCGCAACCACACAGTCTATGTCT-3',

•

5. TACAGCATCCACGCAGGATAGCTTTAATAA-3',

•

5. GTACTGCTACAGAACAGTTAAGTAAATATG-3',

•

5. ATTATGCACTGAAGTAACTAAGGAAGGTAC-3',

•

5. TCTGTGTGTGCTTCTACTACTTCTTCTAT-3',

•

5. ACTATTATTGCAGCTAAAAGCACATTAACT-3',

•

5. ACTTTATGTTCTGAGGAAAAATCAGAGGCT-3',

•

5. TTTGTCTACTACTACTGAATCAGCTGT-3'

•

5. AGTACTGTATCTGCACAATCTGCATCTGCC-3'

•

5. ATTGTCTGCCTGCACCGAAACGGCCAT-3'

•

5. AGGCTAGTAGCTCTACTACAACGTATGC-3'

•

5. GTTTACTCCATCTGTTGCACAAACATTTAC-3',

• 5'-CAATGTATCATGCCTCCTTGCACCATTCTA-3', dichas sondas unidas en sitios preseleccionados de un medio de soporte sólido miniaturizado.

3. El procedimiento según la reivindicación 2 que comprende además secuencias como control de amplificación.

4. El procedimiento según la reivindicación 3, en el que dicho control interno de amplificación son cebadores específicos para r-globina con la siguiente secuencia: f.

5. CTTTCAGGGCAATAATGA-3', g.

5. TGGTAGCTGGATTGTAGC-3'

y sonda con la siguiente secuencia h) 5'GGGTTACGTAAGCTACCTAGCTACTGCATG -3'

5. El procedimiento según las reivindicaciones 1-4 que comprende además las etapas de:

- escanear, mediante medios de lectura óptica, la superficie de un medio de soporte sólido miniaturizado, comprendiendo dicha superficie sitios en los que se ha inducido la hibridación entre la secuencia génica amplificada y las sondas específicas, de manera que se obtiene una imagen de dichos sitios;

- comparar dicha imagen con una imagen de referencia, de manera que se verifique sí y en cuál de dichos sitios se ha obtenido dicha hibridación

- interpretar un resultado analítico como resultado de dicha comparación.

6. El procedimiento según la reivindicación 5, en el que dicho resultado analítico se expresa en términos de la presencia o ausencia de un agente patógeno del VPH.

7. El procedimiento según las reivindicaciones 5-6, en el que las etapas de escanear y comparar están implementadas por ordenador.

8. Un kit que comprende un cebador del VPH de la mezcla de PCR como se define en la reivindicación 1, que comprende además como control interno los siguientes cebadores: 5'-CTTTCAGGGCAATAATGA-3',

5'-TGGTAGCTGGATTGTAGC-3' para llevar a cabo el procedimiento según la reivindicación 3.

9. El kit según la reivindicación 8 que comprende además las sondas específicas para subtipos del VPH como se definen en la reivindicación 2.