Polipéptidos con actividad de fitasa y polinucleótidos que los codifican.

Polipéptido aislado que tiene actividad de fitasa y que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos98,

8% de identidad con los aminoácidos 1 a 411 de SEQ ID nº: 2, donde la identidad se determina por el programa"Align" usando la matriz de puntuación por defecto BLOSUM50, la penalización para el primer residuo en un espacio es-12 mientras que la penalización para residuos adicionales en un espacio es -2, y donde la fitasa tiene actividad residualdespués de una incubación a 37°C y en un tampón de 0,1 M de glicina/HCl pH 2,0 durante 4 horas de al menos 20%.

Polipéptidos con actividad de fitasa y polinucleótidos que los codifican

Antecedentes de la invención Campo de la invención [0001] La presente invención se refiere a polipéptidos aislados con actividad de fitasa y polinucleótidos aislados que codifican los polipéptidos. Los polipéptidos están relacionados con una fitasa derivada de Citrobacter braakii, cuya secuencia de aminoácidos se muestra en el listado de secuencias anexo como SEQ ID nº: 4. La invención también se refiere a constructos de ácido nucleico, vectores y células huésped que incluyen los polinucleótidos, así como a métodos para producir y usar los polipéptidos, en particular en alimentos para animales.

Descripción de las técnicas relacionadas [0002] Las fitasas son enzimas bien conocidas, como lo son las ventajas de añadirlas a productos alimenticios para animales, incluidos seres humanos. Las fitasas se han aislado de muchas fuentes, incluidas varias cepas fúngicas y bacterianas.

La fosfatasa ácida de histidina appA de Escherichia coli al igual que otras fitasas bacterianas gram-negativas se conocen por tener una alta actividad específica.

El gen que codifica una fitasa (phyA) de Citrobacter freundii se describe en Zinin et al., (Citrobacter freundii phyA

gene, complete cds, EMBL, 1 September 2004, XP002339845) . La fitasa deducida es similar a la SEQ ID nº: 2 y 4 de la presente. No se aportan indicaciones de ninguna propiedad.

La producción por Citrobacter braakii YH-15 de una fitasa intracelular se proporciona por Kim et al. en Biotechnology Letters 25: 1231-1234, 2003. La KR-2004-A-045267 y la WO-2004/085638 revelan, como SEQ ID nº: 7,

la secuencia de aminoácidos de una fitasa de Citrobacter braakii YH-15, depositada como KCCM 10427. Esta secuencia de aminoácidos se incluye aquí como SEQ ID nº: 5. La WO-2004/085638 fue publicada el 07.10.2004, es decir después de la primera fecha de prioridad de la presente solicitud.

Un objeto de la presente invención es proporcionar polipéptidos alternativos con actividad de fitasa y

polinucleótidos que codifiquen los polipéptidos. Los polipéptidos de la invención preferiblemente son de propiedades enmendadas, más preferiblemente mejoradas, por ejemplo de una especificidad de sustrato diferente, de una actividad específica más alta, de una estabilidad aumentada (tal como estabilidad al ácido, estabilidad térmica, y/o estabilidad de proteasa, en particular estabilidad de pepsina) , de un pH óptimo enmendado (tal como un pH óptimo más bajo o más alto) y/o de un rendimiento mejorado en el alimento para animales (tal como una liberación y/o degradación mejorada de fitato) .

Resumen de la invención [0007] La presente invención se refiere a polipéptidos con actividad de fitasa y que incluyen una secuencia de 45 aminoácidos que tiene al menos 98, 8% de identidad con los aminoácidos del 1 al 411 de SEQ ID nº: 2, donde la identidad se determina mediante el programa "Align" usando la matriz de puntuación por defecto BLOSUM50, la penalización para el primer residuo en un espacio es -12 mientras que la penalización para los demás residuos en un espacio es -2, y donde la fitasa tiene una actividad residual tras la incubación a 37°C y en un tampón de 0, 1 M de glicina/HCl pH 2, 0 durante 4 horas de al menos 20%.

La invención también se refiere a polinucleótidos aislados que codifican un polipéptido con actividad de fitasa, seleccionado del grupo que consiste en:

(a) un polinucleótido que codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 98, 8% de identidad con los aminoácidos 1 a 411 de SEQ ID nº: 2; donde la identidad se determina por el programa 55 "Align" usando la matriz de puntuación por defecto BLOSUM50, la penalización para el primer residuo en un espacio es -12 mientras que la penalización para residuos adicionales en un espacio es -2, y

(b) un polinucleótido con un mínimo de 98, 5% de identidad con los nucleótidos del 67 al 1299 de SEQ ID nº: 1, donde la identidad se determina mediante el programa "Align" usando la matriz de puntuación por defecto, la penalización para el primer nucleótido en un espacio es -16, mientras que la penalización para nucleótidos 60 adicionales en un espacio es -4, y donde la fitasa codificada tiene una actividad residual tras la incubación a 37°C y en un tampón de 0, 1 M de glicina/HCl pH 2, 0 durante 4 horas de al menos el 20%.

La invención también se refiere a constructos de ácido nucleico, vectores de expresión recombinantes y células 65 huésped recombinantes que incluyen los polinucleótidos.

La invención también se refiere a métodos para producir tales polipéptidos con actividad de fitasa incluyendo: (a) el cultivo de una célula huésped recombinante que comprende un constructo de ácido nucleico que incluye un polinucleótido que codifica el polipéptido bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) la recuperación del polipéptido.

La invención también se refiere a métodos para el uso de los polipéptidos de la invención en alimentos para animales, al igual que en composiciones de alimentos para animales y aditivos para alimentos para animales que contienen los polipéptidos.

También se describe un constructo de ácido nucleico que comprende un gen que codifica una proteína operativamente enlazada a una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal que consiste en: (i) los nucleótidos del 1 al 66 de SEQ ID nº: 1 o (ii) los nucleótidos del 1 al 66 de SEQ ID nº: 3 donde el gen es foráneo de la secuencia de nucleótidos.

Definiciones [0013] Actividad de fitasa: en el presente contexto, un polipéptido con actividad de fitasa (una fitasa) es una enzima que cataliza la hidrólisis de fitato (mioinositol hexaquis-fosfato) a (1) mioinositol y/o (2) mono-, di-, tri-, tetra- y/o pentafosfatos de los mismos y (3) fosfato inorgánico.

El sitio web ENZYME (http://www.expasy.ch/enzyme/) es un depósito de información relacionada con la nomenclatura de enzimas. Principalmente se basa en las recomendaciones del Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistr y and Molecular Biology (Comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (IUB-MB) ) y describe cada tipo de enzima caracterizada para la que se ha proporcionado un número de EC (Comisión Enzimática) (Bairoch A. The ENZYME database, 2000, Nucleic Acids Res 28:304-305) . Véase también el manual de Enzyme Nomenclature de NC-IUBBM, (1992) .

Según el sitio ENZYME, se conocen tres tipos diferentes de fitasas: una 3-fitasa (mioinositol hexafosfato 3fosfohidrolasa, EC 3.1.3.8) , una 6-fitasa (mioinositol hexafosfato 6-fosfohidrolasa, EC 3.1.3.26) , y una 5-fitasa (EC 3.1.3.72) . Para los fines de la presente invención, todos los tipos se incluyen en la definición de fitasa.

Las fitasas de la invención pertenecen a la familia de las fosfatasas ácidas de histidina, que incluyen la fosfatasa ácida de Escherichia coli pH 2, 5 (gen appA) al igual que fitasas fúngicas tales como las fitasas A y B de Aspergillus awamorii (EC: 3.1.3.8) (gen phyA y phyB) . Las fosfatasas ácidas de histidina comparten dos regiones de similitud de secuencia, cada una centrada alrededor de un residuo de histidina conservado. Estas dos histidinas parecen estar implicadas en el mecanismo catalítico de las enzimas. La primera histidina está localizada en la sección N-terminal y forma un intermedio fosfo-histidina mientras que la segunda está localizada en la sección C-terminal y posiblemente actúa como donante de protón.

Las fitasas de la invención tienen un motivo de sitio activo conservado, a saber, R-H-G-X-R-X-P, donde X designa cualquier aminoácido (véanse los aminoácidos 16 a 22 de SEQ ID nº: 2 y 4) .

Para los fines de la presente invención la actividad de fitasa se determina en la unidad de FYT, un FYT es la cantidad de enzima que libera 1 micro-mol de ortofosfato inorgánico por min. bajo las siguientes condiciones: pH 5, 5; temperatura 37°C; sustrato: fitato de sodio (C6H6O24P6Na12) en una concentración de 0, 0050 mol/l. Los ensayos de fitasa adecuados son los ensayos FYT y FTU descritos en el Ejemplo 1 de la WO 00/20569. FTU es para determinar la actividad de fitasa en alimentos y premezclas. La actividad de fitasa también se puede determinar usando los ensayos de fitasa de los Ejemplos 4, 7 y 8 de este documento.

El pH óptimo de un polipéptido de la invención se determina mediante la incubación de la fitasa con varios valores de pH, usando un sustrato en una concentración predeterminada y una temperatura de incubación fija. El pH óptimo se determina luego con una representación gráfica... [Seguir leyendo]

1. Polipéptido aislado que tiene actividad de fitasa y que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 98, 8% de identidad con los aminoácidos 1 a 411 de SEQ ID nº: 2, donde la identidad se determina por el programa "Align" usando la matriz de puntuación por defecto BLOSUM50, la penalización para el primer residuo en un espacio es -12 mientras que la penalización para residuos adicionales en un espacio es -2, y donde la fitasa tiene actividad residual después de una incubación a 37°C y en un tampón de 0, 1 M de glicina/HCl pH 2, 0 durante 4 horas de al menos 20%.

2. Polipéptido de la reivindicación 1 que comprende los aminoácidos 1 a 411 de SEQ ID nº: 4. 10

3. Polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1- 2.

4. Polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene actividad de fitasa, seleccionado del grupo que consiste 15 en:

(a) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 98, 8% de identidad con los aminoácidos 1 a 411 de SEQ ID Nº: 2; donde la identidad se determina por el programa "Align" usando la matriz de puntuación por defecto BLOSUM50, la penalización para el primer residuo en un espacio es -12 mientras que la penalización para residuos adicionales en un espacio es -2, y

(b) un polinucleótido que tiene al menos 98, 5% de identidad con los nucleótidos 67 a 1299 de SEQ ID nº: 1, donde la identidad se determina por el programa "Align" usando la matriz de identidad por defecto, la penalización para el primer nucleótido en un espacio es -16, mientras que la penalización para nucleótidos adicionales en un espacio es -4, y

donde la fitasa codificada tiene una actividad residual después de incubación a 37°C y en un tampón de 0, 1 M de 25 glicina/HCl pH 2, 0 durante 4 horas de al menos 20%.

5. Polinucleótido de la reivindicación 4, seleccionado del grupo que consiste en:

(a) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 1 a 411 de SEQ ID nº: 4 y 30 (b) un polinucleótido que comprende los nucleótidos 67 a 1299 de SEQ ID nº: 3.

6. Constructo de ácido nucleico que incluye el polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 4-5 enlazado operativamente a una o a más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped de expresión.

7. Vector de expresión recombinante que incluye el constructo de ácido nucleico de la reivindicación 6.

8. Célula huésped recombinante que comprende el constructo de ácido nucleico de la reivindicación 6.

9. Método de producción del polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-2 que comprende: (a) cultivo de una célula huésped recombinante que comprende un constructo de ácido nucleico que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperación del polipéptido.

10. Planta transgénica, parte de planta o célula vegetal que se ha transformado con un polinucleótido que codifica el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-2.

11. Animal transgénico no humano, o productos o elementos del mismo, que es capaz de expresar el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-2. 50

12. Uso de al menos un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-2 en alimento para animales.

13. Uso de al menos un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-2 en la preparación de una composición para

su uso en alimento para animales. 55

14. Método para mejorar el valor nutricional de un alimento para animales, donde al menos un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-2 se añade al alimento.

15. Aditivo para alimento para animales que incluye: 60 (a) al menos un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-2 y

(b) al menos una vitamina liposoluble,

(c) al menos una vitamina hidrosoluble, y/o

(d) al menos un oligoelemento.

16. Aditivo para alimento para animales de la reivindicación 15 que comprende además al menos una amilasa, al menos una fitasa adicional, al menos una xilanasa, al menos una galactanasa, al menos una alfa-galactosidasa, al menos una proteasa, al menos una fosfolipasa y/o al menos una beta-glucanasa.

17. Composición de alimento para animales que tiene un contenido de proteína cruda de 50 a 800 g/kg y que comprende al menos un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-2.