MÉTODO DE OBTENCIÓN DE DATOS ÚTILES PARA EL DIAGNÓSTICO DEL CÁNCER DE PÁNCREAS, Y PARA EVALUAR LA RESPUESTA AL TRATAMIENTO.

Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico del cáncer de páncreas,

y para evaluar la respuesta al tratamiento.

Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico en un estadio temprano del adenocarcinoma de páncreas, así como para evaluar la respuesta al tratamiento de dicha enfermedad, que permite el establecimiento de un patrón individual de reconocimiento (cuali- y cuantitativo) específico, que es diferente dependiendo del estado de la enfermedad y se ve modificado post-tratamiento, permitiendo el establecimiento de grupos de pacientes, así como el diagnóstico precoz. Kit que comprende los medios necesarios para llevar a cabo el método de la invención.

MÉTODO DE OBTENCiÓN DE DATOS ÚTILES PARA EL DIAGNÓSTICO DEL CÁNCER DE PÁNCREAS, Y PARA EVALUAR LA RESPUESTA AL TRATAMIENTO.

La presente invención se encuentra dentro de la medicina y la biología molecular, y se refiere a un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico en un estadio temprano del adenocarcinoma de páncreas, así como para evaluar la respuesta al tratamiento de dicha enfermedad, que permite el establecimiento de un patrón individual de reconocimiento (cuali-y

cuantitativo) específico, que es diferente dependiendo del estado de la

enfermedad y se ve modificado post-tratamiento, permitiendo el

establecimiento de grupos de pacientes, así como el diagnóstico precoz.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

El cáncer de páncreas se encuentra entre las cinco primeras causas de muerte por cáncer en el mundo desarrollado con una tasa de supervivencia del 19% a 1 año. Un 95% de tumores malignos del páncreas son adenocarcinoma ductal infiltrante. En la mayoría de los casos se diagnostica en un estado muy avanzado e incluso pacientes con tumores resecables localizados, presentan metástasis. Los tumores que rodean o comprimen estructuras arteriales grandes como las ramas del tronco celíaco o la arteria mesentérica superior son considerados irresecables. La intervención quirúrgica permanece como el tratamiento central, si bien hay que complementarla con otras opciones para aumentar el tiempo de supervivencia. En este sentido, el tratamiento quimioterápico y de radiación se utilizan bien en combinación con la intervención quirúrgica, o bien como tratamiento definitivo en los casos de tumores avanzados, no resecables (Veo et al. Cancer of the Pancreas. Cancer : principies and practice of oncology. Vincent T. DeVita, Jr., Samuel Hellman, Steven A. Rosenberg;7th Edition 2005) . Así, en enfermedad avanzada, la administración de gemcitabina es el agente estándar, combinándola con citostáticos para mejorar la respuesta.

El conocimiento a nivel molecular, de las rutas de señalización que intervienen en la transformación celular ha permitido el desarrollo de tratamientos nuevos contra el cáncer. La desregulación de la señalización a través del receptor del factor de crecimiento epidérmico EGFR está implicada en el proceso de carcinogénesis. Diversos tipos de cáncer tienden a expresar altos niveles de EGFR y su activación inicia una cascada de señalización cuyos componentes son nuevas dianas potenciales para el tratamiento del cáncer. Moléculas como erlotinib, inhibidor de tirosin-quinasa a nivel intracelular, actúa impidiendo la autofosforilación del receptor de EGFR y posterior transducción de la señal.

Los inhibidores de EGFR parecen mostrar máxima actividad en pacientes de cáncer de pulmón con mutaciones activadoras en el dominio citoplásmico. Esto sugiere que los pacientes en los cuales los tumores presenten determinadas mutaciones de este receptor, se beneficiarían de un resultado clínico mejor. Este hecho indicaría que el estudio de la presencia de estas mutaciones en los pacientes se podría utilizar como pauta de aplicación de la terapia para aquellos que respondieran mejor a inhibidores de EGFR (3-5) . Sin embargo, esto no es totalmente cierto, ya que no todos los pacientes con mutaciones detectadas responden al tratamiento, mientras que pacientes sin dichas mutaciones son respondedores. Además de EGFR, otras moléculas parecen tener un papel en la aparición y progresión del cáncer. Así la activación del oncogen K-ras junto con la inactivación de genes supresores tumorales (p53, DPC4, p16, Y BRCA2) se ha asociado con el desarrollo de cáncer de páncreas (Orchekowski et al., 2005. Cancer Res 65:11193-202) .

Por otra parte, ciertos genes se encuentran sobre-expresados en adenocarcinoma de páncreas, entre ellos claudin 4, fascin, Hsp47, mesotelin, Muc4, PSCA, S100A4. Estos datos indican que un estudio del perfil de expresión génica proporciona una oportunidad única para mejorar el conocimiento del diagnóstico y evolución de este letal tumor y proporcionar una mejora en las pautas del tratamiento del paciente, tanto a nivel de búsqueda de biomarcadores apropiados que reflejen una respuesta eficaz como a nivel de aplicación del mejor tratamiento a nivel individual a cada paciente según los biomarcadores que manifiesten.

Por otro lado, las alteraciones genéticas dan lugar a que las células tumorales produzcan diferentes moléculas que están involucradas en la transformación neoplásica y la progresión tumoral. Estas moléculas a menudo hacen emerger señales autocrinas y paracrinas estimuladoras del crecimiento, factores de crecimiento peptídicos secretados, citoquinas y hormonas. Los niveles aumentados de estas moléculas solubles pueden ser utilizados para el diagnóstico del cáncer y el manejo terapéutico. Se ha detectado expresión de proteínas asociadas al cáncer, como HER2, por las células tumorales circulantes en sangre. Estas células tienen valor pronóstico en la enfermedad metastásica, y su presencia aumenta, tras un ciclo de tratamiento, en pacientes con probabilidad de que la terapia fuese inefectiva. Estos resultados indican el valor de utilizar analíticas que permitan la detección en la sangre de los pacientes con cáncer o bien células cancerosas circulantes o las moléculas que puedan producir, y que estén involucradas en el proceso cancerígeno. Este procedimiento es menos invasivo para monitorizar tanto la evolución de la enfermedad como la respuesta a la terapia o intervención quirúrgica. De esta manera, estas moléculas-diana pueden ayudar a caracterizar la biología de la tumorigénesis, la progresión de la enfermedad y además pueden identificar biomarcadores para monitorizar el tratamiento de los pacientes con cáncer.

Una manera de detectar estas moléculas es utilizando anticuerpos específicos, para detectar su presencia en el suero de los pacientes con cáncer, así en pacientes con cáncer de vejiga, la presencia de p331NG1 y ciclina 02, se ha asociado con pérdida de la regulación del ciclo celular; angiostatina y factor de crecimiento epidérmico con repuesta antiangiogénica; osteopontina y CXCR4 con riesgo metastásico. El perfil de proteínas en suero que se pueden detectar utilizando anticuerpos puede ser característico de la enfermedad (Orchekowski et al., 2005. Cancer Res 65:11193-202) . Estas moléculas alcanzan el torrente sanguíneo tanto por secreción o excreción como por mecanismos de degradación incluyendo apoptosis o necrosis tisular. La neovascularización, vías celulares tumorales autocrinas y las paracrinas, son factores colaboradores de que estas dianas antigénicas alcancen la circulación y se puedan detectar en sangre (Burczynski et al., 2006. J Mol Diagn. 8:51-61; Golub et al., 1999. Science 286:531-537; Smirnov et al., 2005. Cancer Researc. 65:4993-4997) .

En el caso del cáncer de páncreas, en un estudio realizado sobre la expresión del antígeno de células madre prostático (PSCA) mRNA se detectó mediante RT-PCR en la sangre de 7 de 11 pacientes con cáncer de páncreas (63, 6%) , y no se observó en la sangre de individuos sanos. Otras alteraciones genéticas características del cáncer de páncreas, como mutación K-ras que está presente en el 80-90% de los casos, pueden detectarse en el plasma de dichos pacientes por la misma técnica, con potencial aplicación en la monitorización de la enfermedad. En esta línea, la viabilidad de medir en sangre periférica moléculas que permitan conocer la evolución de cáncer de páncreas fue la demostración de que los niveles de transcritos de RNAm del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a) en sangre periférica estaban elevados en los 10 pacientes con cáncer de páncreas estudiados comparados con 9 controles sanos (p < 0.05) medidos por Q-RT-PCR y los transcritos de RNAm del TNF-a se redujeron a un nivel similar a los controles tras la extirpación del tumor.

La tecnología actual permite determinar el perfil molecular de la enfermedad, mediante micromatrices (microarrays) capaces de medir simultáneamente los niveles de expresión de miles de genes. Se puede medir la expresión a nivel de ARNm, para ello están los microarrays que utilizan sondas con ADNc u oligonucleótidos sintéticos o medir las proteínas utilizando como "sondas" anticuerpos específicos. En el caso de medir los niveles de expresión de los genes a nivel de ARNm, se puede partir de ARN total o ARNm aislado de la muestra de tejido o de células. Tanto en el caso de partir de ARN total como de ARNm se realiza un paso previo de obtención de ADN complemetario (ADNc) , y posteriormente se realiza una transcripción in vitro para la obtención de ARNc marcado con biotina de manera proporcional al mARN original expresado en el... [Seguir leyendo]

1. Un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico, pronóstico, o

seguimiento del cáncer de páncreas, que comprende:

5  a. obtener una muestra biológica aislada de un individuo, y

b. detectar la cantidad de producto de expresión de:

i. el gen S100A2 y el gen KLRG, en la muestra biológica

aislada de (a) , cuando la muestra se obtiene de un

individuo antes de la intervención quirúrgica,

10  ii. el gen RPS5 y el gen BNIP3L, en la muestra biológica

aislada de (a) , cuando la muestra se obtiene de un

individuo, post-intervención quirúrgica.

2. El método de obtención de datos útiles para el diagnóstico, pronóstico o

15  seguimiento del cáncer de páncreas según la reivindicación anterior, que

además comprende

c. comparar las cantidades obtenidas en el paso (b) con una

cantidad de referencia.

20  3. Un método de diagnóstico, pronóstico o seguimiento del cáncer de

páncreas, que comprende los pasos (a) – (c) del método según la

reivindicación 2, y además comprende:

d. asignar al individuo del paso (a) al grupo de individuos con cáncer

de páncreas cuando presenta un nivel de expresión dos veces

25  superior al de los individuos sanos.

4. Un método de seguimiento de la evolución del cáncer de páncreas, que

comprende los pasos (a) – (c) del método según cualquiera de las

reivindicaciones 2-3, y además:

30  d. repetir al menos dos veces la secuencia de pasos (a) – (c) en

muestras obtenidas del mismo individuo según el paso (a) , de

manera no simultánea.

5. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde la muestra se obtiene de sangre periférica.

6. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde la detección del producto de expresión de se realiza mediante RT-PCR.

5 

7. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde la detección 10 del producto de expresión se realiza mediante un microarray.

8. Un kit o dispositivo que comprende los elementos necesarios para llevar a cabo un método según cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

15  9. Un kit o dispositivo comprende los elementos necesarios para detectar el producto de expresión de:

a. el gen S100A2 y el gen KLRG, en muestras de individuos antes de la intervención quirúrgica,

b. el gen RPS5 y el gen BNIP3L, en muestras de individuos post20 intervención quirúrgica.

10.El uso del kit según cualquiera de las reivindicaciones 8-9, para la obtención de datos útiles en el diagnóstico, pronóstico o seguimiento del cáncer de páncreas.

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