Método para la tinción de materiales biológicos.

Un método para realizar un procedimiento de tinción para una muestra biológica con el propósito de detectar e identificar microorganismos que causan enfermedades,

comprendiendo el método:

grabar una primera imagen de la muestra;

aplicar un agente de tinción a la muestra de manera que se prepare una muestra teñida que comprender una pluralidad de entidades teñidas, y/o una pluralidad de entidades teñidas superficialmente;

grabar una segunda imagen de la muestra teñida;

generar una primera imagen diferencial comparando la segunda imagen con la primera imagen de manera que se determine una posición de al menos una de las entidades teñidas sobre la muestra teñida, si se da el caso;

aplicar un agente decolorante a la muestra teñida de manera que se prepare una muestra parcialmente decolorada en la que al menos una parte del agente de tinción ha sido retirado de las entidades teñidas superficialmente, si se da el caso;

grabar una tercera imagen de la muestra decolorada parcialmente;

generar una segunda imagen diferencial comparando la tercera imagen con la segunda imagen de manera que se determine una posición de al menos una de las entidades teñidas superficialmente sobre la muestra teñida, si se da el caso; y

analizar la segunda imagen diferencial para determinar un tiempo de exposición durante el cual el agente decolorante puede ser aplicado a la muestra decolorada parcialmente para decolorar sustancialmente las entidades teñidas superficialmente, si se da el caso, sin decolorar sustancialmente las entidades teñidas, si se da el caso; y

corregir la aplicación del agente de tinción y / o del agente decolorante en base al menos en parte en al menos una imagen diferencial.

Método para la tinción de materiales biológicos La presente invención se refiere a un método para la tinción de materiales biológicos con el propósito de detectar e identificar microorganismos que causan enfermedades. Más en particular, la presente invención se refiere a un método para realizar la tinción Gram automatizada en portaobjetos de microscopios.

La tinción de Gram es uno de los procedimientos realizados con más frecuencia en los laboratorios de microbiología modernos. Tales procedimientos se utilizan ampliamente para clasificar las bacterias como "Gram positivas" o "Gram negativas". Tras fijar una muestra que contiene bacterias en un portaobjetos de microscopio, la muestra se trata utilizando agentes de tinción como por ejemplo cristal de violeta en combinación con el yodado de Gram. El primer paso tiñe todas las bacterias de un azul oscuro o violeta. La diferencia principal entre las bacterias "Gram positivas"

o "Gram negativas" es que en las muestras "Gram positivas", los agentes de tinción se absorben dentro de la estructura celular completamente, mientras que en las muestras "Gram negativas" la tinción ocurre únicamente superficialmente. En consecuencia, cuando la muestra es tratada a continuación con un agente decolorante (como por ejemplo alcohol ácido) , las bacterias Gram negativas tienden a perder su color, mientras que las bacterias Gram positivas continúan teñidas de azul o violeta.

La tinción Gram se prepara convencionalmente y se analiza manualmente. La tinción Gram manual es intensiva en mano de obra, requiere personal adiestrado, y puede fallar al conseguir unas características de tinción óptimas en la muestra preparada. Una tinción no óptima puede producir falsos Gram positivos así como falsos Gram negativos.

Ha habido diferentes intentos para automatizar el procedimiento de tinción Gram. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos número 4, 029, 470 de Wilkins et al. ("Wilkins") . De manera similar, el Aerospray Slide Stainer, suministrado comercialmente por Wescor, Inc. de Logan, Utah, es un aparato para la tinción automatizada rudimentario. Otros dispositivos de tinción incluyen el Midas III Slide Stainer, suministrado comercialmente por Merck KGaA de Darmstadt, Alemania; el Poli Stainer, que es suministrado comercialmente por IUL Instruments GmbH de Koenigswinter, Alemania; y el Automated Gram Stainer, suministrado comercialmente por GG&B Company de Wichita Falls, Texas y descrito de manera general en el documento de Patente de los Estados Unidos número 6, 468, 764 de Gibbs et al. Ninguno de estos instrumentos o técnicas, sin embargo, permiten la capacidad de aplicar tinte y / o agentes decolorantes antes, durante y / o después del examen y / o del procesamiento de la imagen de la muestra en el portaobjetos.

En consecuencia, existe una necesidad para un método y un sistema de tinción automatizada mejorada.

SUMARIO DE LA INVENCION El método de la presente invención está definido en la reivindicación 1. El método de la invención comprende un paso para grabar una primera imagen de la muestra y aplicar un agente de tinción a la muestra de manera que se prepare una muestra teñida que comprende una pluralidad de entidades teñidas.

La pluralidad de entidades teñidas puede incluir al menos una de las pluralidades de entidades teñidas o de la pluralidad de entidades teñidas superficialmente. En algunas de tales realizaciones, el agente de tinción puede comprender un tinte Gram de manera que las entidades teñidas superficialmente, si están presentes, comprendan una pluralidad de entidades Gram negativas, de manera que las entidades teñidas, si están presentes, comprendan una pluralidad de entidades Gram positivas. El método de la invención puede comprender además grabar una segunda imagen de la muestra teñida y generar una primera imagen diferencial comparando la segunda imagen con la primera imagen de manera que se determine una posición de al menos una de las entidades teñidas en la superficie.

El método de la invención puede comprender además aplicar un agente decolorante a la muestra teñida de manera que se prepare una muestra parcialmente decolorada en la que al menos una parte del agente de tinción es eliminado de las entidades teñidas superficialmente, grabando una tercera imagen de la muestra parcialmente decolorada y generando una segunda imagen diferencial comparando la tercera imagen con la segunda imagen de manera que se determine una posición de al menos una de las entidades teñidas superficialmente sobre la superficie. Finalmente, el método de la invención comprende analizar la segunda imagen diferencial para determinar un tiempo de exposición durante el cual el agente decolorante podría ser aplicado a la muestra parcialmente decolorada para decolorar sustancialmente las entidades teñidas superficialmente sin decolorar sustancialmente las entidades teñidas.

En algunas realizaciones, el método puede comprender también aplicar el agente decolorante a a muestra parcialmente decolorada para determinar el tiempo de exposición de manera que se prepare una muestra sustancialmente decolorada mientras las entidades teñidas superficialmente son decoloradas sustancialmente y en la que las entidades tintadas no son decoloradas sustancialmente. En algunas de dichas realizaciones, el método puede comprender además: (1) grabar una cuarta imagen de la muestra sustancialmente decolorada; (2) generar una tercera imagen diferencial comparando la cuarta con la segunda imagen, en el que la tercera imagen diferencial

muestra la posición de al menos una de las entidades teñidas superficialmente en la superficie; y (3) generar una cuarta imagen diferencial comparando la cuarta imagen con la primera imagen, en el que la cuarta imagen diferencial muestra una posición de al menos una de las entidades teñidas sobre la superficie. En realizaciones del método en la que las posiciones de las entidades teñidas y de las entidades teñida superficialmente son discernibles al menos parcialmente en al menos una de la tercera o de la cuarta imagen diferencial, el método puede comprender también analizar una morfología de las entidades teñidas y / o de las entidades teñidas superficialmente.

BREVE DESCRIPCION DE LAS DIFERENTES VISTAS DE LOS DIBUJOS Habiendo descrito así la invención en términos generales, será hecha ahora referencia a los dibujos que se acompañan, que no están dibujados necesariamente a escala, y en los que:

Las Figuras 1 a 10 muestran unas series de imágenes de "línea sencilla" grabadas de una muestra que contiene tanto entidades teñidas (esto es Gram positivas, por ejemplo) como superficialmente teñidas (esto es Gram negativas, por ejemplo) , de acuerdo con una realización de la presente invención; La Figura 1 muestra una representación no limitativa de una imagen de "línea sencilla" de una muestra no teñida, que corresponde a una primera imagen producida de acuerdo con una realización de la presente invención; La Figura 2 muestra un esquema no limitativo de una "línea sencilla" de una muestra, mostrando las posiciones de las entidades teñidas (esto es entidades Gram positivas) en la muestra, de acuerdo con una realización de la presente invención; La Figura 3 muestra un esquema no limitativo de una "línea sencilla" de una muestra, mostrado las posiciones de entidades teñidas superficialmente (esto es entidades Gram negativas) en la muestra, de acuerdo con una realización de la presente invención; La Figura 4 muestra una representación no limitativa de una imagen de "línea sencilla" de una muestra teñida, que corresponde a una segunda imagen producida de acuerdo con una realización de la presente invención; La Figura 5 muestra una representación no limitativa de una imagen de "línea sencilla" de la muestra, que corresponde a una primera imagen diferencial producida de acuerdo con una realización de la presente invención, que destaca las posiciones de las entidades teñidas y teñidas superficialmente de la muestra; La Figura 6 muestra una representación no limitativa de una imagen de "línea sencilla" de la muestra, que corresponde a una tercera imagen, producida de acuerdo con una realización de la presente invención, tras una decoloración del 35 % de la muestra; La Figura 7 muestra una representación no limitativa de una imagen de "línea sencilla" de la muestra, que corresponde a una segunda imagen diferencial, producida de acuerdo con una realización de la presente invención, que destaca el efecto de la decoloración del 35 % en las entidades teñidas superficialmente de la muestra; La Figura 8 muestra una representación no limitativa de una imagen de "línea sencilla" de la muestra, que corresponde a una cuarta imagen, producida de acuerdo con una... [Seguir leyendo]

1. Un método para realizar un procedimiento de tinción para una muestra biológica con el propósito de detectar e identificar microorganismos que causan enfermedades, comprendiendo el método:

grabar una primera imagen de la muestra; aplicar un agente de tinción a la muestra de manera que se prepare una muestra teñida que comprender una pluralidad de entidades teñidas, y/o una pluralidad de entidades teñidas superficialmente; grabar una segunda imagen de la muestra teñida;

generar una primera imagen diferencial comparando la segunda imagen con la primera imagen de manera que se determine una posición de al menos una de las entidades teñidas sobre la muestra teñida, si se da el caso; aplicar un agente decolorante a la muestra teñida de manera que se prepare una muestra parcialmente decolorada en la que al menos una parte del agente de tinción ha sido retirado de las entidades teñidas superficialmente, si se da el caso; grabar una tercera imagen de la muestra decolorada parcialmente; generar una segunda imagen diferencial comparando la tercera imagen con la segunda imagen de manera que se determine una posición de al menos una de las entidades teñidas superficialmente sobre la muestra teñida, si se da el caso; y

analizar la segunda imagen diferencial para determinar un tiempo de exposición durante el cual el agente decolorante puede ser aplicado a la muestra decolorada parcialmente para decolorar sustancialmente las entidades teñidas superficialmente, si se da el caso, sin decolorar sustancialmente las entidades teñidas, si se da el caso; y corregir la aplicación del agente de tinción y / o del agente decolorante en base al menos en parte en al menos una imagen diferencial.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprender además aplicar el agente decolorante a la muestra parcialmente decolorada para el tiempo de exposición determinado de manera que se prepare una muestra sustancialmente decolorada en la que las entidades teñidas superficialmente estén sustancialmente decoloradas y en la que las entidades teñidas no estén sustancialmente decoloradas.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende además:

grabar una cuarta imagen de la muestra sustancialmente decolorada;

generar una tercera imagen diferencial comparando la cuarta imagen con la segunda imagen, describiendo la tercera imagen diferencial la posición de al menos una de las entidades teñidas superficialmente sobre la superficie y generar una cuarta imagen diferencial comparando la cuarta imagen con la primera imagen, describiendo la cuarta imagen diferencial una posición de al menos una de las entidades teñidas sobre la superficie.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende además analizar una morfología de al menos una de las entidades teñidas superficialmente, o de las entidades teñidas.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el agente de tinción comprende un tinte Gram y en el 45 que las entidades teñidas superficialmente comprenden una pluralidad de bacterias Gram negativas, y en el que las entidades teñidas comprenden una pluralidad de bacterias Gram positivas.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, comprendiendo además:

reaplicar el agente de tinción y / o el agente decolorante de acuerdo con el paso de corrección; y generar una imagen final de la muestra de manera que se diferencie al menos un objeto de interés en la muestra que se convierta en discernible por la aplicar de nuevo del paso.