Integración de almacenamiento de muestras y gestión de muestras para las ciencias biológicas.

Una matriz para el almacenamiento en seco de una muestra biológica,

que comprende:

(a) un material matriz que se disuelve o disocia en un disolvente, que permite la recuperación completa o sustancial de una muestra biológica secada o un material biológico, después de hidratación, rehidratación u otra reconstitución con disolvente de la muestra, en la que el material matriz comprende un material seleccionado de poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, carboximetilcelulosa, 2-hidroxietilcelulosa y poli(2-etil-2-oxazolina), o en donde el material matriz comprende al menos un material seleccionado del grupo que consiste en polietilenglicol, agarosa, poli-N-vinilacetamida, poli(4-vinilpiridina), poli(óxido de fenileno), acrilamida reticulada, polimetacrilato, nanotubos de carbono, polilactida, copolímero de lactida/glicólido, copolímero de hidroximetacrilato, pectinato de calcio, acetatosuccinato de hidroxipropilmetilcelulosa, proteoglicano sulfato de heparina, ácido hialurónico, ácido glucurónico, dominio N-terminal de la trombospondina-1 de unión de la heparina, fibronectina, un conjugado de péptido/modificador polimérico soluble en agua y colágeno, o comprende al menos un material matriz que comprende un polímero, en el que el polímero no se autoensambla de forma covalente y tiene la fórmula

-[-X-]nen

la que X es -CH3, -CH2-, -CH2CH(OH)-, -CH2CH(OH)- sustituido, -CH2CH(COOH)-, -CH2CH(COOH)- sustituido, -CH≥CH2, -CH≥CH-, alquilo C1-C24 o alquilo sustituido, alquenilo C2-24 o alquenilo sustituido, polioxietileno, polioxipropileno, o un copolímero aleatorio o de bloques de los mismos; y en el que n es un número entero que tiene un valor de aproximadamente 1-100, 101-500, 501-1000, 1001-1500, o 1501-3000; y

(b) al menos un estabilizante que comprende un inhibidor que es un inhibidor biológico o un inhibidor bioquímico, en el que el inhibidor biológico o inhibidor bioquímico es validamicina A;

en la que la matriz se prepara por secado de una solución que comprende de 0,1% a 10% en peso-volumen del material matriz;

en la que la matriz se obtiene por secado al aire a temperatura ambiente o a una temperatura elevada adecuada, y/o por secado bajo una corriente de gas adecuado, tal como una corriente de aire filtrado, CO2, o un gas inerte tal como nitrógeno u otro gas de secado adecuado, de una solución.

Integración de almacenamiento de muestras y gestión de muestras para las ciencias biológicas 5 CAMPO TÉCNICO

[1] La presente invención se refiere en general a composiciones y procedimientos mejorados para el almacenamiento de muestras biológicas y para procedimientos mediante los cuales se reciben materiales y muestras biológicas y se ponen en sistemas de inventario. La invención también se refiere al uso, organización, 1 almacenamiento, seguimiento, recuperación y análisis de dichos materiales y muestras biológicas y a la automatización de estos procedimientos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[2] La investigación en el campo de las ciencias biológicas se basa en el análisis de materiales y muestras biológicas, tales como ADN, ARN, sangre, orina, frotis bucales, bacterias, virus, productos de PCR, ADN clonado, proteínas, células y tejidos, y de minerales o productos químicos. Dichas muestras típicamente se recogen o se obtienen a partir de fuentes adecuadas y se ponen en almacenamiento e inventario para el posterior procesamiento

y análisis.

[3] Los recipientes de almacenamiento para dichas muestras incluyen botellas, tubos, viales, bolsas, cajas, rejillas, platos de múltiples pocilios y placas de múltiples pocilios, que típicamente están cerrados mediante tapas de rosca o tapas a presión individuales, cierres a presión o herméticos, cubiertas, tiras o cintas adhesivas o tiras de múltiples tapones. El formato de recipiente estándar para almacenamiento de muestras, procesamiento y

automatización de procesos biológicos de capacidad media a alta, es una placa o matriz de 96, 384 o 1536 pocilios. Los recipientes y las muestras contenidas en los mismos se almacenan a diferentes temperaturas, por ejemplo a temperatura ambiente o a 4 °C o a temperaturas inferiores a °C, típicamente de aproximadamente -2 °C o de -7 °C a -8 °C. Las muestras que se ponen y almacenan en los dispositivos, lo más frecuente es que estén contenidas en medio líquido o una solución tampón, y requieren almacenamiento a temperaturas bajo cero (p. ej., de -2 °C o 3 -7 a -8 °C). En algunos casos, las muestras primero se secan y después se almacenan a temperatura ambiente, o a 4 °C, a -2 °C o de -7 a -8 °C.

[4] Por ejemplo, actualmente, los ácidos nucleicos se almacenan en forma líquida a temperaturas bajas. Para el almacenamiento a corto plazo, los ácidos nucleicos se pueden almacenar a 4 °C. Para el almacenamiento a

largo plazo, la temperatura en general se baja a de -2 °C a -7 °C para prevenir la degradación del material genético, en particular en el caso de ADN y ARN genómicos. Los ácidos nucleicos también se almacenan a temperatura ambiente en matrices sólidas tales como membranas de celulosa. Ambos sistemas de almacenamiento están asociados con desventajas. El almacenamiento a baja temperatura requiere equipamiento costoso tal como cámaras frigoríficas, congeladores, sistemas de generadores eléctricos de reserva; dicho equipamiento puede no ser 4 fiable en casos de cortes de energía inesperados o puede ser difícil de usar en zonas sin una fuente de electricidad lista o que tienen sistemas eléctricos no fiables. El almacenamiento de ácidos nucleicos sobre fibras de celulosa también da como resultado una pérdida sustancial de material durante el procedimiento de rehidratación, puesto que el ácido nucleico permanece atrapado y por lo tanto asociado con las fibras de celulosa en lugar de ser cuantitativamente recuperable. El almacenamiento en seco de ácidos nucleicos sobre celulosa también requiere la 45 separación de la celulosa del material biológico, puesto que de lo contrario las fibras de celulosa contaminan las muestras biológicas. La separación de los ácidos nucleicos de las fibras de celulosa requiere la manipulación adicional, incluyendo etapas de pipeteo, transferencia de las muestras a tubos o recipientes nuevos, y centrifugación, todas las cuales pueden dar como resultado rendimientos de recuperación reducidos y más oportunidades para la introducción de contaminante no deseados o la exposición a condiciones que promueven la 5 degradación de muestras, y que también son costosos y laboriosos.

[5] Las proteínas actualmente se manipulan principalmente en fases líquidas, en entornos enfriados o congelados, típicamente en el intervalo de -2 °C a almacenamiento en nitrógeno líquido. En algunas excepciones las proteínas se pueden liofilizar o secar a temperatura ambiente en presencia de trehalosa y aplicar directamente a

una superficie no tratada. (García de Castro y col., 2 Appl. Environ. Microbiol. 66:4142; Manzanera y col., 22 Appl. Environ. Microbiol. 68:4328) Las proteínas a menudo se degradan y/o pierden actividad incluso cuando se almacenan refrigeradas (4 °C), o congeladas (-2 °C o -8 °C). El estrés de la congelación-descongelación en las proteínas reduce la bioactividad de las proteínas (p. ej., la actividad enzimática, la unión específica a un ligando cognado, etc.) en especial si se requiere la congelación-descongelación repetida de partes alícuotas de una muestra

de proteína. La consecuente pérdida de actividad de la proteína que puede ser necesaria para ensayos biológicos típicamente requiere el reajuste de la concentración de proteína con el fin de obtener resultados de ensayos comparables, o el rechazo costoso de reactivos de proteínas comprometidos en favor de adquirir nuevos lotes. La práctica común de tener reactivos enzimáticos de múltiples usos almacenados en un laboratorio, en especial por 5 diferente usuarios en diferentes momentos y usando procedimiento de manipulación no estandarizados, reduce más la fiabilidad de los datos experimentales generados con dichos reactivos. Como resultado, la semivida de las proteínas se reduce y con frecuencia deben sustituirse reactivos caros, implicando enormes costes financieros para el usuario. El proveedor de proteínas tiene altos costes para mantener una cadena de suministro congelado no interrumpida que empieza con tratamientos iniciales en cámaras refrigeradas, para el transporte, almacenamiento 1 congelado de la muestra y transporte congelado de la proteína desde la producción al sitio de uso. Por ejemplo, los retrasos durante el transporte pueden producir la inactivación de proteínas, que después deben reemplazarse con un gran coste para el proveedor; la recepción del producto desactivado también puede dar como resultado clientes insatisfechos.

[6] El secado de proteínas y ácidos nucleicos todavía debe ser adoptado de forma universal en la investigación científica, biomédica, biotecnología y otras comunidades empresariales industriales, debido a la falta de estándares establecidos y procedimientos fiables, dificultados con recuperaciones de propiedades cuantitativas y funcionales, compatibilidades y tolerancias de tampones y disolventes variables, y otras dificultades que surgen de las demandas de manipulación de ácidos nucleicos y proteínas. Se aplican los mismos problemas a la manipulación, 2 almacenamiento y uso de otros materiales biológicos, tales como virus, fagos, bacterias, células y organismos multicelulares. Se han descrito por ejemplo disacáridos tales como la trehalosa o lactitol, como aditivos para el almacenamiento en seco de muestras que contienen proteínas (p. ej., patente de EE.UU. n° 4.891.319; patente de EE.UU. n° 5.834.254; patente de EE.UU. n° 6.896.894; patente de EE.UU. n° 5.876.992; patente de EE.UU. n° 5.24.843; WO 9/5182; WO 91/14773), pero la utilidad de dichos compuestos en los contextos descritos está 25 comprometida por servir como fuente de energía para contaminantes microbianos no deseados, por sus efectos estabilizantes limitados cuando se usan como se describe, por su falta de aplicabilidad general en una amplia variedad de muestras biológicas y por otros factores.

[7] Los recipientes de almacenamiento de muestras presentes representan una multitud de plataformas sin 3 un procedimiento unificado de preparación de muestras, almacenamiento de muestras, inventario de muestras,

seguimiento de muestras, recuperación de muestras y análisis de muestras. Está claro que ninguno de los formatos de almacenamiento y procesamiento de muestras actuales resuelve los problemas que surgen de los recipientes de almacenamiento individuales, cierre y auxiliares de depósito inadecuados, contaminación de la muestra, organización inadecuada, sistemas de etiquetado diversos, requisitos de almacenamiento y espacio grandes y 35 restricciones de temperatura.

[8] La era genómica y el reciente descifrado del genoma humano y muchos otros genomas, proteomas, transen piornas, etc. han conducido a la industrialización de la investigación de las ciencias biológicas. Se están analizando millones de muestras... [Seguir leyendo]

1. Una matriz para el almacenamiento en seco de una muestra biológica, que comprende:

(a) un material matriz que se disuelve o disocia en un disolvente, que permite la recuperación completa o sustancial de una muestra biológica secada o un material biológico, después de hidratación, rehidratación u otra reconstitución con disolvente de la muestra, en la que el material matriz comprende un material seleccionado de poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, carboximetilcelulosa, 2-hidroxietilcelulosa y poli(2-etil-2-oxazolina), o en donde el material matriz comprende al menos un material seleccionado del grupo que consiste en polietilenglicol, agarosa, 1 poli-N-vinilacetamida, poli(4-vinilpiridina), poli(óxido de fenileno), acrilamida reticulada, polimetacrilato, nanotubos de carbono, polilactida, copolímero de lactida/glicólido, copolímero de hidroximetacrilato, pectinato de calcio, acetato- succinato de hidroxipropilmetilcelulosa, proteoglicano sulfato de heparina, ácido hialurónico, ácido glucurónico, dominio N-terminal de la trombospondina-1 de unión de la heparina, fibronectina, un conjugado de péptido/modificador polimérico soluble en agua y colágeno, o comprende al menos un material matriz que 15 comprende un polímero, en el que el polímero no se autoensambla de forma covalente y tiene la fórmula

en la que X es -CHs, -CH2-, -CH2CH(OH)-, -CH2CH(OH)- sustituido, -CH2CH(COOH)-, -CH2CH(COOH)- sustituido, 2 -CH=CH2, -CHCH-, alquilo Ci-C24 o alquilo sustituido, alquenilo C2-24 o alquenilo sustituido, polioxietileno, polioxipropileno, o un copolímero aleatorio o de bloques de los mismos; y en el que n es un número entero que tiene un valor de aproximadamente 1-1, 11-5, 51-1, 11-15, o 151-3; y

(b) al menos un estabilizante que comprende un inhibidor que es un inhibidor biológico o un inhibidor bioquímico, en 25 el que el inhibidor biológico o inhibidor bioquímico es validamicina A;

en la que la matriz se prepara por secado de una solución que comprende de ,1% a 1% en peso-volumen del material matriz;

en la que la matriz se obtiene por secado al aire a temperatura ambiente o a una temperatura elevada adecuada, y/o por secado bajo una corriente de gas adecuado, tal como una corriente de aire filtrado, C2, o un gas inerte tal como nitrógeno u otro gas de secado adecuado, de una solución.

2. La matriz de la reivindicación 1, en la que el disolvente comprende un disolvente biocompatible.

3. La matriz de la reivindicación 2, en la que el material matriz se disuelve en el disolvente biocompatible.

4. La matriz de la reivindicación 1, en la que el material matriz comprende poli(alcohol vinílico).

5. La matriz de la reivindicación 4, en la que la matriz se seca a partir de una solución que comprende de

,1% a 1% en peso-volumen de poli(alcohol vinílico).

6. La matriz de la reivindicación 4, en la que la matriz se seca a partir de una solución que comprende de ,5% a 5% en peso-volumen de poli(alcohol vinílico).

7. La matriz de la reivindicación 4, en la que la matriz se seca a partir de una solución que comprende de 1% a 5% en peso-volumen de poli(alcohol vinílico).

8. La matriz de la reivindicación 4, en la que la matriz se seca a partir de una solución que comprende de 5 ,5% a 1,5% en peso-volumen de poli(alcohol vinílico).

9. La matriz de la reivindicación 4, en donde la matriz se seca a partir de una solución que se selecciona del grupo que consiste en:

(i) solución que comprende 1% en peso-volumen de poli(alcohol vinílico),

(¡i) solución que comprende 3% en peso-volumen de poli(alcohol vinílico),

(i¡¡) solución que comprende 5% en peso-volumen de poli(alcohol vinílico),

(iv) solución que comprende 1% en peso-volumen de poli(alcohol vinílico) y 5% en peso-volumen de trehalosa,

(v) una solución que comprende 1% en peso-volumen de poli(alcohol vinílico) y 5% en peso-volumen de

validamicina A, y

(vi) una solución que comprende 1% en peso-volumen de poli(alcohol vinílico), 5% en peso-volumen de trehalosa y 5% en peso-volumen de validamicina A.

1. Una matriz de acuerdo con la reivindicación 4, en la que la matriz se seca a partir de una solución que

se selecciona del grupo que consiste en:

(i) una solución que comprende de 1% en peso-volumen a 5% en peso-volumen de poli(alcohol vinílico) y 5% en peso-volumen de validamicina A; y

(ii) una solución que comprende 1% en peso-volumen de poli(alcohol vinílico) y de 1% a 1% en peso-volumen de validamicina A.

11. Una matriz para el almacenamiento en seco de una muestra biológica de acuerdo con la reivindicación 2 1, que además comprende un tampón que puede mantener un pH deseado.

12. La matriz de la reivindicación 11, en la que el tampón comprende un compuesto que se selecciona del grupo que consiste en Tris, citrato, acetato, fosfato, borato, HEPES, MES, MOPS, PIPES, carbonato y bicarbonato.

13. Una matriz para el almacenamiento en seco de una muestra biológica de acuerdo con la reivindicación

1, que comprende al menos un indicador detectable.

14. La matriz de la reivindicación 13, en la que el indicador detectable comprende un indicador colorimétrico.

15. La matriz de la reivindicación 13, en la que el indicador detectable comprende uno o una pluralidad de compuestos de marcador de GCMS.

16. La matriz de la reivindicación 13, en la que el indicador detectable se selecciona del grupo que

consiste en un indicador fluorescente, un indicador luminiscente, un indicador fosforescente, un indicador

radiométrico, un colorante, una enzima, un sustrato de una enzima, una molécula de transferencia de energía, y un

marcador de afinidad.

17. La matriz de la reivindicación 13, en la que el indicador detectable puede indicar de forma detectable 4 la presencia de al menos uno de una amina, un alcohol, un aldehido, agua, un tiol, un sulfuro, un nitrito, avidina,

biotina, una inmunoglobulina, un oligosacárido, un ácido nucleico, un polipéptido, una enzima, una proteína citoesquelética, una especie de oxígeno reactiva, un ion metálico, pH, Na+, K+, CL, un cianuro, un fosfato y selenio.

18. La matriz de la reivindicación 13, en la que el indicador detectable se selecciona del grupo que

consiste en rojo de fenol, bromuro de etidio, una ADN polimerasa, una endonucleasa de restricción, cloruro de

cobalto, colorante de Reichardty un sustrato de proteasa fluorogénico.

19. La matriz de la reivindicación 1, en la que el material matriz puede almacenar en seco la muestra biológica sin refrigeración.

2. Un procedimiento de almacenamiento de una muestra biológica, que comprende:

poner en contacto una muestra biológica con una matriz para el almacenamiento sustancialmente en seco de una muestra biológica, comprendiendo la matriz 55

(i) un material matriz como se define en la reivindicación 1; y

(ii) al menos un estabilizante como se define en la reivindicación 1,

en el que la matriz se prepara por secado a partir de una solución que comprende de ,1% a 1% en peso-volumen del material matriz;

en el que la matriz se obtiene por secado al aire a temperatura ambiente o a una temperatura elevada adecuada, y/o 5 por secado bajo una corriente de gas adecuado, tal como una corriente de aire filtrado, CO2, o un gas inerte tal como nitrógeno u otro gas de secado adecuado, de una solución;

y así almacenar la muestra biológica.

21. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el material matriz comprende

poli(alcohol vinílico).