Inmunoensayos sensibles usando nanopartículas recubiertas.

Un procedimiento para determinar la presencia o ausencia de un analito en una muestra líquida,

que comprende:

(a) proporcionar un dispositivo de ensayo para determinar la presencia o ausencia de un analito en una muestra líquida, que comprende:

(i) un miembro receptor de la muestra;

(ii) un vehículo en comunicación fluida con el miembro receptor de la muestra;

(iii) un reactivo marcado que es móvil en el vehículo en presencia de la muestra líquida, el reactivo marcado que comprende un ligando que se une al analito y una nanopartícula recubierta que consiste en un núcleo de oro y una cubierta que tiene el ligando unido a la misma, en el que la cubierta comprende vidrio, un material cerámico tal como perovskita y ZrO2, o un polímero tal como polietilenglicol, polimetilmetacrilato y poliestireno, y aumenta la reflectancia de la nanopartícula, y en el que la nanopartícula recubierta no incluye una molécula activa en Raman; y

(iv) un reactivo de unión eficaz para capturar el analito, cuando está presente, inmovilizado en una zona de detección definida del vehículo;

(b) poner en contacto la muestra líquida con el miembro receptor de la muestra del dispositivo de ensayo;

(c) dejar que la muestra líquida aplicada al miembro receptor de la muestra movilice dicho reactivo marcado de tal manera que la muestra líquida y el reactivo marcado se muevan a lo largo de la longitud del vehículo para pasar a la zona de detección;

(d) detectar la presencia del reactivo marcado en la zona de detección mediante la medición de la reflectancia, en el que la detección del reactivo marcado en la zona de detección es indicativa de la presencia de analito en la muestra líquida, y el fracaso en la detección de la presencia del reactivo marcado en la zona de detección es indicativo de la ausencia del analito en la muestra líquida.

Inmunoensayos sensibles usando nanopartículas recubiertas Campo Se proporcionan nanopartículas recubiertas que comprenden un núcleo rodeado por una cubierta que aumenta la reflectancia de la nanopartícula, en las que la nanopartícula recubierto no necesita, pero puede opcionalmente, incluir una molécula activa de Raman. Las nanopartículas recubiertas divulgadas en el presente documento son útiles en dispositivos y procedimientos de prueba para la determinación cuantitativa y / o cualitativa de la presencia o ausencia de un analito en una muestra líquida.

Antecedentes La tecnología del inmunoensayo proporciona un medio sencillo y relativamente rápido para determinar la presencia o ausencia de analitos en muestras biológicas. La información proporcionada por las pruebas diagnósticas de inmunoensayo es a menudo crucial para la atención al paciente. Normalmente, los ensayos se realizan para detectar cualitativa o cuantitativamente la presencia de analitos particulares, por ejemplo, los anticuerpos que están presentes cuando un sujeto humano tiene una enfermedad o afección concreta. Los inmunoensayos practicados en la técnica son numerosos e incluyen ensayos para enfermedades, tales como infecciones causadas por bacterias o virus, o estados, tal como el embarazo.

En la técnica se conocen varios tipos de inmunoensayos. Un tipo de procedimiento de inmunoensayo es el inmunoensayo de flujo lateral. Los ensayos de flujo lateral utilizan un soporte sólido, tal como nitrocelulosa, plástico

o vidrio, para llevar a cabo la detección del analito. En lugar de extraer la muestra a través del soporte perpendicularmente, como en el caso de un ensayo de "flujo a través", se permite que la muestra fluya lateralmente a lo largo del soporte por capilaridad y otras fuerzas de una zona de aplicación a una zona de reacción en la superficie. En un ensayo de flujo lateral, los anticuerpos de captura se aplican por raspado sobre el soporte sólido. Los anticuerpos de detección se conjugan con una molécula de detección, que proporciona una señal que es detectable. Una muestra líquida se pone en contacto con los anticuerpos de detección y se permite que la mezcla de muestra/anticuerpo de detección fluya a lo largo del soporte sólido. Si el analito está presente, se forma un complejo de "sándwich" en el lugar sobre el soporte sólido en el que se han aplicado por raspado los anticuerpos de captura. La señal de la molécula de detección localizada en la línea de captura se detecta a continuación, ya sea visualmente

o con un instrumento. Un ensayo de flujo lateral se puede configurar para detectar proteínas, ácidos nucleicos, metabolitos, células, moléculas pequeñas u otros analitos de interés.

Otro formato de inmunoensayo es un inmunoensayo de flujo a través. Generalmente, un inmunoensayo de flujo a través usa un material poroso con una matriz que contiene reactivo en capas sobre la mismo o incorporada en la misma. La muestra de ensayo se aplica a al material poroso y fluye a su través, y el analito en la muestra reacciona con el o los reactivos para producir una señal detectable sobre el material poroso. Estos dispositivos generalmente están encerrados dentro de una carcasa o estuche de plástico con calibraciones para ayudar a la detección del analito concreto.

Muchos ejemplos de diferentes tipos de moléculas de detección útiles en los inmunoensayos de flujo lateral se conocen en la técnica, tales como fluoróforos, coloides de oro, partículas de látex marcadas y nanopartículas, tales como un punto cuántico o una nanopartícula de dispersión de Raman potenciada en superficie ("SERS") . Por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº 5.591.645 describe el uso de moléculas "trazadoras" visibles, tales como oro coloidal, que se pueden ver sin el uso de instrumentación. Adicionalmente, la patente de EE.UU. Nº 6.514.767 de Natan divulga nanopartículas compuestas activas en SERS (SACN) que comprenden una nanopartícula de metal que se ha unido o asociado con su superficie una o más moléculas activas en Raman y está encapsulada por una cubierta que comprende un polímero, vidrio o cualquier otro material dieléctrico. La patente de EE.UU. Nº 5.714.389 describe procedimientos de inmunoensayo de flujo lateral y dispositivos de ensayo utilizando una partícula coloreada que puede ser un coloide metálico, preferentemente oro. Del mismo modo, la patente de EE.UU. Nº 7.109.042 describe dispositivos de inmunoensayo de flujo lateral que utilizan marcadores directos, tales como soles de oro y soles de colorante, que permiten La producción de un resultado analítico instantáneo sin la necesidad de añadir reactivos adicionales a fin de desarrollar una señal detectable. El documento WO2007/090058 divulga inmunoensayos de flujo lateral usando partículas de metal de encapsulación, en particular nanopartículas de SERS encapsuladas, como la modalidad de detección. Se observó una mejora de la sensibilidad del inmunoensayo de flujo lateral preparado para la lectura visual.

El SERS es uno de los procedimientos más sensibles para la realización de análisis químicos, lo que permite la detección de una sola molécula. Véase Nie, S. y S. R. Emor y , "Probing Single Molecules and Single Nanoparticles by Surface Enhanced Raman Scattering", Science, 275.1102 (1997) . Un espectro Raman, similar a un espectro de infrarrojos, incluye una distribución de la longitud de onda de las bandas correspondiente a las vibraciones moleculares específicas de la muestra que se está analizando (el analito) . En la práctica de la espectroscopia Raman, el haz procedente de una fuente de luz, generalmente un láser, se centra en la muestra para generar con ello la radiación inelásticamente dispersada, que se recoge y dirige ópticamente hacia un espectrómetro dispersivo

de longitud de onda o transformada de Fourier en el que un detector convierte la energía de los fotones que impactan en intensidad de señal eléctrica.

La muy baja conversión de la radiación incidente en radiación dispersa inelástica limitó la espectroscopia Raman a aplicaciones que eran difíciles de realizar mediante espectroscopia de infrarrojos, tales como el análisis de las soluciones acuosas. No obstante, en 1974 se descubrió que cuando una molécula en las proximidades de un electrodo de plata rugosa se somete a una fuente de excitación Raman, la intensidad de la señal generada se incrementa por tanto como seis órdenes de magnitud.

(Fleischmann, M., Hendra, P. J., y McQuillan, A. J., "Raman Spectra of Pyridine Adsorbed at a Silver Electrode, " Chem. Phys. Lett, 26, 123, (1974) , y Weaver, M. J., Farquharson, S., Tadayyoni, M. A., "Surface-enhancement 10 factors for Raman scattering at silver electrodes. Role of adsorbate-surface interactions and electrode structure, " J. Chem. Phys., 82, 4867 4874 (1985) ) . En pocas palabras, los fotones del láser incidente se acoplan para conducir libremente los electrones dentro del metal que, confinado por la superficie de la partícula, causan, en conjunto, que la nube de electrones resuene. El campo de plasmón superficial resultante proporciona una vía eficiente para la transferencia de energía a los modos de vibración molecular de una molécula dentro del campo y, por lo tanto, 15 genera fotones Raman. Las nanopartículas SERS se han utilizado como una molécula de detección en inmunoensayos de flujo lateral. Por ejemplo, Oxonica (Kidlington, Reino Unido) ha desarrollado nanopartículas Nanoplex para su uso en dichos ensayos. Las nanopartículas constan de un núcleo de nanopartícula de oro, sobre el cual se han adsorbido moléculas indicadoras de Raman capaces de generar una señal de espectroscopia Raman potenciada en superficie. La nanopartícula de oro marcada Raman está recubierta con una cubierta de sílice 20 de aproximadamente 10-50 nm de espesor. La cubierta de sílice protege al indicador de la desorción de la superficie, impide las interacciones plasmón-plasmón entre partículas de oro adyacentes y también evita la generación de señales SERS desde los componentes en la solución. Las nanopartículas SERS que tienen un recubrimiento de polímero en lugar del recubrimiento de sílice se describen en la solicitud de patente de EE.UU. Nº 2007/0165219. El documento WO00/31538 divulga ensayos de flujo lateral que usan oro coloidal como mediciones del marcador y de reflectancia para la detección.

Al tiempo que aprovecha la alta sensibilidad de SERS, la detección de la señal producida a partir de una nanopartícula SERS requiere el uso de un instrumento capaz de detectar una señal Raman. En algunas circunstancias puede ser ventajoso tener nanopartícula para su uso en un inmunoensayo de flujo lateral que posea una mayor sensibilidad, tal vez comparable a la de una nanopartícula... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para determinar la presencia o ausencia de un analito en una muestra líquida, que comprende:

(a) proporcionar un dispositivo de ensayo para determinar la presencia o ausencia de un analito en una muestra líquida, que comprende:

(i) un miembro receptor de la muestra;

(ii) un vehículo en comunicación fluida con el miembro receptor de la muestra;

(iii) un reactivo marcado que es móvil en el vehículo en presencia de la muestra líquida, el reactivo marcado que comprende un ligando que se une al analito y una nanopartícula recubierta que consiste en un núcleo de oro y una cubierta que tiene el ligando unido a la misma, en el que la cubierta comprende vidrio, un material cerámico tal como perovskita y ZrO2, o un polímero tal como polietilenglicol, polimetilmetacrilato y poliestireno, y aumenta la reflectancia de la nanopartícula, y en el que la nanopartícula recubierta no incluye una molécula activa en Raman; y

(iv) un reactivo de unión eficaz para capturar el analito, cuando está presente, inmovilizado en una zona de detección definida del vehículo;

(b) poner en contacto la muestra líquida con el miembro receptor de la muestra del dispositivo de ensayo;

(c) dejar que la muestra líquida aplicada al miembro receptor de la muestra movilice dicho reactivo marcado de tal manera que la muestra líquida y el reactivo marcado se muevan a lo largo de la longitud del vehículo para pasar a la zona de detección;

(d) detectar la presencia del reactivo marcado en la zona de detección mediante la medición de la reflectancia, en el que la detección del reactivo marcado en la zona de detección es indicativa de la presencia de analito en la muestra líquida, y el fracaso en la detección de la presencia del reactivo marcado en la zona de detección es indicativo de la ausencia del analito en la muestra líquida.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que

(i) el vehículo comprende nitrocelulosa, plástico o vidrio, preferentemente el vehículo comprende nitrocelulosa; o

(ii) el analito es una proteína, ácido nucleico, metabolito, molécula pequeña, virus, bacteria o;

(iii) el dispositivo de ensayo comprende además una almohadilla absorbente en comunicación fluida con la zona de detección; o

(iv) el dispositivo de ensayo comprende además una zona de control en comunicación fluida con la zona de detección; o

(v) la presencia del analito en la muestra líquida se determina cuantitativamente; o

(vi) el dispositivo de ensayo está configurado para detectar múltiples analitos, preferentemente el dispositivo de ensayo comprende adicionalmente al menos dos reactivos marcados diferentes, en el que los ligandos de los reactivos marcados se unen a diferentes analitos y al menos dos zonas de detección para la detección de cada uno de los al menos dos reactivos marcados diferentes.

3. Un procedimiento para determinar la presencia o ausencia de un analito en una muestra líquida, que comprende:

a) proporcionar un dispositivo de ensayo que comprende: (i) un miembro receptor de la muestra; (Ii) un vehículo en comunicación fluida con el miembro receptor de la muestra; y (iii) un reactivo de unión eficaz para capturar el analito, cuando está presente, inmovilizado en una zona de detección definida del vehículo; b) mezclar la muestra líquida con un reactivo marcado que comprende un ligando que se une al analito y una nanopartícula recubierta que consiste en un núcleo de oro y una cubierta que tiene el ligando unido a la misma, en el que la cubierta comprende vidrio, un material cerámico tal como perovskita y ZrO2, o un polímero tal como polietilenglicol, polimetilmetacrilato y poliestireno, y aumenta la reflectancia de la nanopartícula, en el que la nanopartícula recubierta no incluye una molécula activa en Raman; c) poner en contacto la mezcla de b) con el miembro receptor de la muestra del dispositivo de ensayo; d) dejar que la mezcla de b) aplicada al miembro receptor de la muestra se mueva a lo largo de la longitud del vehículo para pasar a la zona de detección; e) detectar la presencia del reactivo marcado en la zona de detección mediante la medición de la reflectancia, en el que la detección del reactivo marcado en la zona de detección es indicativa de la presencia de analito en la muestra líquida, y el fracaso en la detección de la presencia del reactivo marcado en la zona de detección es indicativo de la ausencia del analito en la muestra líquida.

4. El procedimiento de la reivindicación 1 o 3, en el que

(i) se usa un lector de reflectancia para detectar el reactivo marcado en la zona de detección; o

(ii) la presencia de analito en la muestra líquida se determina cuantitativamente; o

(iii) el procedimiento detecta múltiples analitos en la muestra líquida, preferentemente el dispositivo de ensayo comprende adicionalmente al menos dos reactivos marcados diferentes, en el que los ligandos de los reactivos marcados se unen a diferentes analitos y al menos dos zonas de detección para la detección de cada uno de los al menosdos reactivos marcados diferentes.

5. Un procedimiento para determinar la presencia o ausencia de un analito en una muestra líquida usando un kit para realizar un ensayo analítico de flujo pasante para la detección de la presencia o ausencia de un analito en una muestra líquida mediante reflectometría, comprendiendo dicho kit:

(i) un dispositivo de ensayo que comprende una membrana porosa que comprende una superficie superior y una superficie inferior y un reactivo de unión eficaz para capturar el analito, cuando está presente en la muestra líquida, unido a la superficie superior o inferior de la membrana porosa; y

(ii) un reactivo marcado que comprende un ligando que se une al analito y una nanopartícula recubierta que consiste en un núcleo de oro y una cubierta que tiene el ligando unido a la misma, en el que la cubierta comprende vidrio, un material cerámico tal como perovskita y ZrO2, o un polímero tal como polietilenglicol, polimetilmetacrilato y poliestireno, y aumenta la reflectancia de la nanopartícula, en el que la nanopartícula recubierta no incluye una molécula activa en Raman, comprendiendo dicho procedimiento:

(a) poner en contacto la muestra líquida con la superficie superior de la membrana porosa;

(b) dejar que la muestra líquida fluya a través de la membrana porosa, de tal manera que al menos una parte del analito, cuando está presente en la muestra líquida, se una al reactivo de unión;

(c) poner en contacto con el reactivo marcado con la superficie superior de la membrana porosa;

(d) dejar que el reactivo marcado fluya a través de la membrana porosa, de tal forma que al menos una porción del reactivo marcado se una al analito; y

(e) detectar la presencia del reactivo marcado en la membrana porosa mediante la medición de la reflectancia, en el que la detección del reactivo marcado en la membrana porosa es indicativa de la presencia de analito en la muestra líquida, y el fracaso en la detección de la presencia del reactivo marcado en la membrana porosa es indicativo de la ausencia del analito en la muestra líquida.

6. Un procedimiento para determinar la presencia o ausencia de un analito en una muestra líquida usando un kit para realizar un ensayo analítico de flujo pasante para la detección de la presencia o ausencia de un analito en una muestra líquida mediante reflectometría, comprendiendo dicho kit:

(i) un dispositivo de ensayo que comprende una membrana porosa que comprende una superficie superior y una superficie inferior y un reactivo de unión eficaz para capturar el analito, cuando está presente en la muestra líquida, unido a la superficie superior o inferior de la membrana porosa; y

(ii) un reactivo marcado que comprende un ligando que se une al analito y una nanopartícula recubierta que consiste en un núcleo de oro y una cubierta que tiene el ligando unido a la misma, en el que la cubierta comprende vidrio, un material cerámico tal como perovskita y ZrO2, o un polímero tal como polietilenglicol, polimetilmetacrilato y poliestireno, y aumenta la reflectancia de la nanopartícula, en el que la nanopartícula recubierta no incluye una molécula activa en Raman,

comprendiendo dicho procedimiento:

(a) mezclar la muestra líquida con el reactivo marcado de tal manera que el analito, cuando está presente en la muestra de líquido, se une al reactivo marcado;

(b) poner en contacto la mezcla de (A) con la superficie superior de la membrana porosa;

(c) dejar que la mezcla de (a) fluya a través de la membrana porosa, de tal forma que al menos una porción del analito unido al reactivo marcado se una al reactivo de unión; y

(d) detectar la presencia del reactivo marcado en la membrana porosa mediante la medición de la reflectancia, en el que la detección del reactivo marcado en la membrana porosa es indicativa de la presencia de analito en la muestra líquida, y el fracaso en la detección de la presencia del reactivo marcado en la membrana porosa es indicativo de la ausencia del analito en la muestra líquida.

7. El procedimiento de la reivindicación 5 o 6, en el que

(i) se usa un lector de reflectancia para detectar el reactivo marcado sobre la membrana porosa; o

(ii) la presencia de analito en la muestra líquida se determina cuantitativamente; o

(iii) el procedimiento detecta múltiples analitos en la muestra líquida, preferentemente el dispositivo de ensayo comprende adicionalmente al menos dos reactivos marcados diferentes, en el que los ligandos de los reactivos marcados se unen a diferentes analitos y al menos dos zonas de detección para la detección de cada uno de al menos dos reactivos marcados diferentes.

8. El procedimiento de la reivindicación 5 o 6, en el que en el kit:

(i) el analito es una proteína, ácido nucleico, metabolito, molécula pequeña, virus, bacteria; o

(ii) el dispositivo de ensayo comprende además una almohadilla absorbente, en el que la superficie inferior de la membrana porosa y la almohadilla absorbente están en contacto físico y en comunicación fluida, y en el que el reactivo de unión está unido a la superficie superior de la membrana porosa; o

(iii) el dispositivo de ensayo comprende además un alojamiento para la membrana porosa; o (iv) la presencia de analito en la muestra líquida se determina cuantitativamente; o

(v) el dispositivo de ensayo está configurado para detectar múltiples analitos, preferentemente el dispositivo de ensayo comprende adicionalmente al menos dos reactivos marcados diferentes, en el que los ligandos de los reactivos marcados se unen a diferentes analitos y al menos dos zonas de detección para la detección de cada uno de los al menos dos reactivos marcados diferentes.

9. Un sistema que comprende

(l) un dispositivo de ensayo para determinar la presencia o ausencia de un analito en una muestra líquida, que comprende:

(i) un miembro receptor de la muestra;

(ii) un vehículo en comunicación de fluido con el miembro receptor de la muestra;

(iii) un reactivo marcado que es móvil en el vehículo en presencia de la muestra líquida, el reactivo marcado comprende un ligando que se une al analito y una nanopartícula recubierta que consiste en un núcleo de oro y una cubierta que tiene el ligando unido a la misma, en el que la cubierta comprende vidrio, un material cerámico tal como perovskita y ZrO2, o un polímero tal como polietilenglicol, polimetilmetacrilato y poliestireno, y aumenta la reflectancia de la nanopartícula, y en el que la nanopartícula recubierta no incluye una molécula activa en Raman; y

(iv) un reactivo de unión eficaz para capturar el analito, cuando está presente, inmovilizado en una zona de detección definida del vehículo; en el que la muestra líquida aplicada al miembro receptor de la muestra moviliza el reactivo marcado, de tal manera que la muestra y el reactivo marcado se transportan a lo largo de la longitud del vehículo para pasar a la zona de detección, y en el que la detección del reactivo marcado en la zona de detección es indicativa de la presencia de analito en la muestra líquida, y

(II) un reflectómetro adaptado para detectar la presencia del reactivo marcado en el dispositivo de ensayo.

10. El sistema de la reivindicación 9, en el que en el dispositivo de ensayo (i) el vehículo comprende nitrocelulosa, plástico o vidrio, preferentemente el vehículo comprende nitrocelulosa; o (ii) el analito es una proteína, ácido nucleico, metabolito, molécula pequeña, virus, bacteria o;

(iii) el dispositivo de ensayo comprende además una almohadilla absorbente en comunicación de fluido con la zona de detección; o

(iv) el dispositivo de ensayo comprende además una zona de control en comunicación de fluido con la zona de detección; o

(v) la presencia del analito en la muestra líquida se determina cuantitativamente; o

(vi) el dispositivo de ensayo está configurado para detectar múltiples analitos, preferentemente el dispositivo de ensayo comprende adicionalmente al menos dos reactivos marcados diferentes, en el que los ligandos de los reactivos marcados se unen a diferentes analitos y al menos dos zonas de detección para la detección de cada uno de los al menos dos reactivos marcados diferentes.

11. Un sistema que comprende

(I) un kit para realizar un ensayo analítico de flujo pasante para la detección de la presencia o ausencia de un analito en una muestra líquida mediante reflectometría, que comprende:

(i) un dispositivo de ensayo que comprende una membrana porosa que comprende una superficie superior y una superficie inferior y un reactivo de unión eficaz para capturar el analito, cuando está presente en la muestra líquida, unido a la superficie superior o inferior de la membrana porosa; y

(ii) un reactivo marcado que comprende un ligando que se une al analito y una nanopartícula recubierta que consiste en un núcleo de oro y una cubierta que tiene el ligando unido a la misma, en el que la cubierta comprende vidrio, un material cerámico tal como perovskita y ZrO2, o un polímero tal como polietilenglicol, polimetilmetacrilato y poliestireno, y aumenta la reflectancia de la nanopartícula, en el que la nanopartícula recubierta no incluye una molécula activa en Raman, y

(II) un reflectómetro adaptado para detectar la presencia del reactivo marcado en el dispositivo de ensayo.

12. El sistema de la reivindicación 11, en el que en el kit

(i) el analito es una proteína, ácido nucleico, metabolito, molécula pequeña, virus, bacteria; o

(ii) el dispositivo de ensayo comprende además una almohadilla absorbente, en el que la superficie inferior de la membrana porosa y la almohadilla absorbente están en contacto físico y en comunicación de fluido, y en el que el reactivo de unión está unido a la superficie superior de la membrana porosa; o

(iii) el dispositivo de ensayo comprende además un alojamiento para la membrana porosa; o

(iv) la presencia de analito en la muestra líquida se determina cuantitativamente; o

(v) el dispositivo de ensayo está configurado para detectar múltiples analitos, preferentemente el dispositivo de ensayo comprende adicionalmente al menos dos reactivos marcados diferentes, en el que los ligandos de los reactivos marcados se unen a diferentes analitos y al menos dos zonas de detección para la detección de cada

uno de al menos dos reactivos marcados diferentes.