DILUYENTE PARA LA CONGELACIÓN DE SEMEN EQUINO ADAPTABLE A CADA INDIVIDUO.

Diluyente para la congelación de semen equino adaptable a cada individuo.

Esta invención se refiere a un diluyente de congelación para esperma equino que comprende solución salina balanceada de Hank, de 0,1% a 10% p/v de fosfocaseinato, de 1% a 10% p/v de hidroxietilalmidón y al menos un crioprotector.

La presente invención se refiere a una composición y a su uso como diluyente para la congelación de semen, en particular de semen equino. Por tanto, la invención se podría encuadrar en el campo de la ganadería equina.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

El sector de la ganadería equina se caracteriza por la producción y cría de ejemplares de alto valor individual, en la que se buscan características morfológicas y funcionales específicas dependiendo de cada raza.

A diferencia de otros sectores ganaderos, en los que la unidad productiva es el grupo de animales "producción del rebaño", en el sector equino la unidad productiva es el individuo. Así, mientras que en el sector ganadero en general, si un individuo no posee eyaculados de una calidad aceptable, se elimina el individuo de la cadena productiva y su sustitución, en la industria equina esto no es una opción, debido al alto valor individual de los sementales, bien por su morfología, bien por su funcionalidad.

Además como resultado de una selección que no ha tenido en cuenta la calidad seminal, nos encontramos con una gran variabilidad individual en dicha calidad y en la respuesta a la congelación entre sementales. Sin embargo, debido a su alto valor, la estrategia de congelar semen de todos los sementales es esencial.

La congelación de semen equino en nuestro país, y en toda Europa se viene realizando con tres tipos básicos de diluyentes, diluyentes basados en una solución de lactosa al 11 % con yema de huevo y glicerol a concentraciones que varían entre el 2 y el 5% (Martin et al., J.Reprod. Fértil. Suppl. 1979, (27):47-51, diluyentes comerciales a base de yema de huevo, como el Ghent Minitüb, o leche desnatada, como INRAFreeze IMV. Sin embargo, tanto con los diluyentes comerciales como con los de laboratorio se observa una alta mortalidad espermática y además los espermatozoides supervivientes presentan diversos grados de daño no letal (Ortega Ferrusola et al., J Androl. 2008, 29(2):213-21), pero que disminuye su vida media en el tracto genital de la yegua, dificultando el manejo reproductivo y

disminuyendo aún más la fertilidad. Es decir, disminuye la fertilidad por la alta mortalidad espermática durante la congelación y además por la menor vida media de los que sobreviven el proceso.

Es conocido que el principal daño que sufren los espermatozoides durante el proceso de congelación-descongelación es debido al shock osmótico que experimentan durante la congelación debido a la pérdida de agua intracelular, y durante la descongelación debido a la rehidratación brusca.

Los medios de congelación actuales no tienen en cuenta uno de los principales problemas que presenta la congelación de semen equino, la alta variabilidad individual y la necesidad de desarrollar protocolos individualizados para cada semental. Esto causa que sementales de un alto valor genético no puedan ver su semen congelado. En general, la federación hípica internacional determina que los eyaculados han de tener al menos un 35% de motilidad progresiva a la descongelación para poder entrar en un programa comercial.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un diluyente para la congelación de semen equino que puede modularse y adaptarse de forma individual a cada individuo para la congelación de semen equino, basado en combinaciones de crioprotectores alternativos, y a concentraciones específicas que minimizan el daño osmótico tanto durante la congelación como posterior descongelación permitiendo obtener unas tasas de supervivencia de los espermatozoides equinos post descongelación muy superiores a los medios actualmente disponibles en el mercado.

Por tanto, un primer aspecto de la presente invención se refiere a una composición que comprende:

a) solución salina balanceada de Hank;

b) de 0,1% a 10% p/v de fosfocaseinato;

c) de 1% a 10% p/v de hidroxietilalmidón;

d) al menos un crioprotector.

Un segundo aspecto de la presente invención se refiere al uso de la composición tal y como

se ha descrito anteriormente como diluyente de congelación de esperma.

Un tercer aspecto de la presente invención se refiere a una dosis de inseminación que comprende la composición tal y como se ha descrito anteriormente.

Un cuarto aspecto de la presente invención se refiere a un kit para la preparación de la composición tal y como se ha descrito anteriormente que comprende:

a) solución salina balanceada de Hank,

b) de 0,1% a 10% p/v de fosfocaseinato;

c) de 1% a 10% p/v de hidroxietilalmidón;

d) al menos un crioprotector.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Un primer aspecto de la presente invención se refiere a una composición que comprende:

a) solución salina balanceada;

b) de 0,1% a 10% p/v de fosfocaseinato cálcico;

c) de 1% a 10% p/v de hidroxietilalmidón;

d) al menos un crioprotector.

Por solución salina balanceada se entiende una solución hecha a pH fisiológico y a concentración de sales fisiológica. Estas soluciones normalmente incluyen sodio, potasio, calcio, magnesio y cloro. Normalmente se usan para lavar tejidos y células y se suelen combinar con otros agentes para tratar tejidos y células. Proporcionan agua e iones inorgánicos a las células, y mantienen el pH fisiológico. La solución salina balanceada se selecciona de solución de Alsever, solución de Earle, solución de Gey, solución de Hanks, solución de Dulbecco, solución de Puck, solución de Ringer, solución de Simm y solución de Tyrode, preferiblemente la solución salina balanceada es la solución de Hank.

Por solución salina balanceada de Hank (también llamada solución fisiológica de Hank) se entiende una solución que comprende NaCI, KCI, MgS04.7H20, CaCI2.H20, Na2HP04, KH2P04, NaHC03 y glucosa. Las proporciones de dichas sales son bien conocidas para un experto en la técnica, pero a modo de ilustración, una posible composición de una solución

balanceada de Hank comprendería 0,14 g de CaCl2, 0,40 g de KCl, 0,06 g de KH2PO4, 0,2 g de MgSO4.7H2O, 8 g de NaCl, 0,35 g de NaHCO3 y 13,5 g de glucosa. Además, la solución balanceada de Hank comprende de 0,1% a 1% p/v de ácido 4-(2-hidroxietil)-piperazina etanosulfónico, conocido normalmente por su acrónimo en inglés, HEPES. El HEPES permite ajustar el pH.

Por fosfocaseinato cálcico se entiende fosfocaseinato nativo de leche. Preferiblemente el fosfocaseinato nativo de leche se obtiene a partir de leche desnatada según lo descrito en Puliot et al "On the conventional cross 'flow microfiltration of skim milk for the production of native phosphocaseinate" (International Dairy Journal, 6(1), 1996, pp. 105-11. El fosfocaseinato cálcico tiene la función de protección de membrana.

El hidroxietilalmidón son polímeros naturales de la amilopectina, modificados químicamente por una hidroxietilación en la subunidad de los carbonos C2, C3 y C6 de la glucosa. La amilopectina, molécula ramificada, puede proceder del almidón de maíz o de la patata. El hidroxietilalmidón permite reducir la concentración o sustituir a la yema de huevo como protector de membrana durante la criopreservación. Así como la yema de huevo, el hidroxietilalmidón tiene la función de protección de membrana.

La principal ventaja de esta invención es que se pueden preparar diluyentes sin o con muy poca yema de huevo, y es por tanto una alternativa por bioseguridad. Actualmente la legislación en muchos países prevé la retirada de la yema de huevo debido al riesgo biológico (principalmente la trasmisión de patógenos) que supone en diluyentes de congelación.

En una primera realización del primer aspecto de la presente invención, la composición comprende de 0,5% a 7% p/v de fosfocaseinato, preferiblemente de 1% a 5% p/v de fosfocaseinato.

En otra realización del primer aspecto de la presente invención, la composición comprende de 1% a 40% en peso de hidroxietilalmidón.

Aunque el hidroxietilalmidón sustituye a la yema de huevo, sería posible también usarlos en combinación. En otra realización del primer aspecto de la presente invención la composición además comprende de 0,1% a 5% v/v de yema de huevo. La yema de huevo normalmente

se somete a una centrifugación, preferiblemente durante aproximadamente 15 min y 2000 rpm, y se escoge la fracción superior del tubo.

En otra realización del primer aspecto de la presente invención, la composición además comprende de 0,5 mM a 3 mM de cafeína.

En otra realización del primer aspecto de la presente invención, la composición además comprende de 0,1 nm a 5 pM de melatonina.

En otra realización del primer aspecto de... [Seguir leyendo]

1. Composición que comprende:

a) solución salina balanceada;

b) de 0,1% a 10% p/v de fosfocaseinato cálcico;

c) de 1% a 10% p/v de hidroxietilalmidón;

d) al menos un crioprotector.

2. La composición según la reivindicación anterior, donde la solución salina balanceada es la solución salina de Hank.

3. La composición según la reivindicación anterior caracterizada porque comprende de 0,5% a 7% p/v de fosfocaseinato cálcico.

4. La composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque comprende de 1% a 5% p/v de fosfocaseinato cálcico.

5. La composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende de 2% a 10% en peso de hidroxietilalmidón.

6. La composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque además comprende de 0,1% a 5% v/v de yema de huevo.

7. La composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque además comprende de 0,5 mM a 3 mM de cafeína.

8. La composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque además comprende de 0,1 nm a 5 pM de melatonina.

9. La composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque además comprende de3 1 mM a 100 mM de taurina.

10. La composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque además comprende de 1 mM a 100 mM de cisteína.

11. La composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque además comprende de 1 mM a 100 mM de penicilamina.

12. La composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque el crioprotector se selecciona de N-metilformamida, N,N-dimetilformamida, 1,2,3- propanotriol y cualquiera de sus mezclas.

13. La composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la

concentración del crioprotector es 0,1% a 15% v/v respecto al volumen total.

14. La composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el

crioprotector comprende N-metilformamida.

15. La composición según la reivindicación anterior, donde la concentración de N- metilformamida es de 0,5% a 8% v/v respecto al volumen total.

16. La composición según la reivindicación anterior, donde la concentración de de N- metilformamida es de 1% a 6% v/v respecto al volumen total.

17. La composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el

crioprotector comprende N,N-dimetilformamida.

18. La composición según la reivindicación anterior, donde la concentración de N,N- dimetilformamida es de 0,5% a 7% v/v respecto al volumen total.

19. La composición según la reivindicación anterior, donde la concentración de N,N- dimetilformamida es de 1% a 5% v/v respecto al volumen total.

20. La composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el

crioprotector comprende 1,2,3-propanotriol.

21. La composición según la reivindicación anterior, donde la concentración de 1,2,3- propanotriol es de 0,3% a 5% v/v respecto al volumen total.

22. La composición según la reivindicación anterior, donde la concentración de 1,2,3- propanotriol es de 0,5% a 3% v/v respecto al volumen total.

23. Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores como 5 diluyente de congelación de esperma.

24. Uso según la reivindicación anterior donde el esperma es esperma equino.

25. Dosis de inseminación que comprende la composición según cualquiera de las 10 reivindicaciones 1 a 22.

26. Kit para la preparación la composición según las reivindicaciones 1 a 22 que comprende:

a) solución salina balanceada,

b) de 0,1% a 10% p/v de fosfocaseinato cálcico;

c) de 1% a 10% p/v de hidroxietilalmidón;

d) al menos un crioprotector.

27. Kit según la reivindicación anterior, donde la a) solución salina balanceada de Hank, b) 20 de de 0,1% a 10% p/v de fosfocaseinato cálcico y c) de 1% a 10% p/v de hidroxietilalmidón

están premezclados formando parte de una única solución.

28. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 26 o 27 donde el crioprotector se selecciona de N-metilformamida, N,N-dimetilformamida, 1,2,3-propanotriol y cualquiera de sus mezclas.