Cabezal de dosificación.

Cabezal de dosificación (30) para el uso en un dispositivo de coloración automático (10) para exámenes en serie en el ámbito de la sanidad para la dosificación de reactivos sobre una pluralidad de portaobjetos (50),

que comprende una pluralidad de depósitos de almacenamiento (31) que son apropiados para recibir reactivos líquidos y que en un extremo presentan una válvula de dosificación (33) para la dosificación y aplicación de los reactivos sobre los portaobjetos (50), en donde los depósitos de almacenamiento (31) presentan una cubierta (32) en el extremo opuesto a las válvulas de dosificación (33) y el cabezal de dosificación (30) está formado por placas o bloques sustituibles, en donde la cubiertas (32), los depósitos de almacenamiento (31) y/o las válvulas de dosificación (33) forman respectivamente un bloque unido en forma de unidad, caracterizado por que la cubierta (32) es una cubierta hermética al gas (32), en donde la cubierta (32) presenta una conexión provista de válvulas de entrada para la aplicación de una sobrepresión de gas y el volumen medio de los depósitos de almacenamiento (31) es de por lo menos 2,5 ml.

Cabezal de dosificación Ámbito de la invención La presente invención se refiere a un dispositivo automático para la dosificación de reactivos sobre portaobjetos, en donde los portaobjetos comprenden respectivamente una pluralidad de depresiones mutuamente delimitadas, que son apropiadas para recibir muestras celulares y tisulares. El dispositivo contiene un cabezal de dosificación posicionable para la aplicación de reactivos líquidos apropiados en las depresiones de los portaobjetos. La invención se refiere además a un cabezal de dosificación removible, que puede ser montado en el dispositivo, así como un procedimiento para la dosificación automática de los reactivos en las depresiones mutuamente delimitadas de los portaobjetos.

Estado de la técnica

En el pasado reciente, debido al mejoramiento de los procedimientos de análisis inmunohistoquímicos y de biología molecular, se ha generado una mayor demanda de exámenes tisulares. En particular en el marco de la oncología, en el diagnóstico y tratamiento de enfermedades cancerosas, se apuesta en creciente medida por el análisis de expresión genética.

A este respecto, las muestras de tejido son examinadas directa o indirectamente mediante chips específicos para el tumor en relación a si determinados genes están activados o desactivados o, respectivamente, si existen cambios genéticos (por ejemplo, mutaciones) . A este respecto, las muestras tisulares o celulares pueden ser tratadas con anticuerpos o con sondas de ADN o ARN, respectivamente, que luego llevan a una comprobación específica mediante procedimientos de teñido de los genes o productos genéticos (mARN o antígenos) . Un método de teñido estándar inmunohistoquímico es, por ejemplo, el así llamado método del complejo de avidina-biotina (ABC) , que se describe en Hsu, S.M. et al., J. Histochem. Cytochem, 29, 577 -580. En la primera etapa de este método, el anticuerpo primario se liga al correspondiente antígeno tisular. Después de una o varias etapas de lavado se efectúa la ligadura de un anticuerpo secundario biotinilado al anticuerpo primario. Después de una o varias etapas de lavado adicionales se aplica un complejo de avidina-biotina-enzima, que se vincula con alta afinidad a la molécula de biotina del anticuerpo secundario. Esto va seguido nuevamente por una o varias etapas de lavado y luego se aplica un cromógeno que en una reacción de coloración reacciona con el complejo de avidina-biotina-enzima con formación de un producto de reacción teñido visible. Los procedimientos biológicos moleculares comprenden la hibridación in situ (ISH) y la hibridación in situ de fluorescencia (FISH) , en las que se determina el ácido nucleico, es decir, ARN o ADN, por ejemplo, en tejidos o en células individuales. Para esto se usan sondas producidas artificialmente de ácido nucleico, que mediante pares de bases hibridizan el ácido nucleico a ser determinado. En el método de FISH, la sonda es determinada mediante el uso de un colorante fluorescente.

En los análisis de expresión genética se aprovecha el hecho de que de los aproximadamente 25.000 a 30.000 genes de una célula se analizan simultáneamente miles de ellos o incluso todos. Se supone que de los aproximadamente 25.000 genes sólo alrededor de la mitad están activos al mismo tiempo en una célula y que de estos sólo algunos cientos de genes de una célula tienen una relevancia o especificidad tumoral o patológica. De esta manera, con aproximadamente 200 genes se pueden distinguir específicamente los linfomas de células de manto de todos los demás linfomas (se conocen aproximadamente 40 entidades diferentes, que a su vez se pueden clasificar en numerosos subgrupos) . Con un número comparable de genes completamente distintos, por ejemplo los linfomas de células de manto se pueden separar de todos los demás tumores. Y también es posible que con un número de algunos cientos de genes se pueda efectuar la distinción entre linfocitos reactivos y linfocitos neoplásticos de un linfoma de células de manto.

Mediante análisis estadísticos de tales análisis de expresión globales muchas veces se logra una significativa reducción de datos y se generan las así llamadas huellas dactilares genéticas, por ejemplo, de tumores o procesos patológicos, que posteriormente se pueden usar como marcadores de diagnóstico. A este respecto, normalmente no se observa ningún menoscabo significativo en la confiabilidad de los análisis. Así, por ejemplo, de aproximadamente 30 genes, que son significativos para los linfomas de células B altamente malignos, se pueden seleccionar respectivamente tres genes que respectivamente se correlacionan más intensamente con un buen pronóstico o que se correlacionan más intensamente con un mal pronóstico. Si estos seis genes se incluyen entonces en una fórmula matemática de pronóstico con un factor positivo o negativo, respectivamente, se puede lograr una afirmación estadística muy buena en cuanto a la supervivencia del paciente. Esta predicción puede ser integrada entonces con una plusvalía significativa para el paciente en los razonamientos clínicos terapéuticos.

Debido a que los tejidos y las células mueren muy rápidamente después de ser extraídos del organismo y se descomponen en el proceso de la necrosis, en el que pueden destruirse los orgánulos, las estructuras celulares y también la arquitectura tisular, los análisis de tejido se efectúan sobre todo en el así llamado tejido FFPE (fijado con formalina y embebido en parafina) . Para el diagnóstico en el material FFPE actualmente se dispone de aproximadamente 250 anticuerpos establecidos, en donde para el análisis frecuentemente se usan los así llamados

algoritmos. A este respecto, los tumores en primer lugar son examinados morfológicamente de manera convencional con coloraciones estándar. El patólogo llega entonces a un diagnóstico de sospecha o a diferentes razonamientos de diagnóstico diferencial, en los que se consideran, por ejemplo, 3 o 4 diagnósticos diferentes. Para llegar a un diagnóstico definitivo, se efectúa entonces un número variable de reacciones de coloración inmunohistoquímicas o biológicas moleculares. Para lograr que esto sea lo más económicamente favorable posible, la coloración se hace con los así llamados paneles de anticuerpos algorítmicos, es decir, grupos de anticuerpos específicamente estructurados. Un panel de anticuerpos algorítmico puede comprender, por ejemplo, de cuatro a seis anticuerpos. Diferentes paneles de anticuerpos pueden estar en una relación mutual lógica (por ejemplo, jerárquica) , o también se pueden reunir en grupos para determinadas enfermedades. El patólogo procesa los cuestionamientos diagnósticos de manera cada vez más diferenciada de panel a panel, hasta que finalmente se haya establecido el diagnóstico.

De esto resulta que con el material tisular de un paciente es necesario efectuar y evaluar, por ejemplo, entre 10 y 50 exámenes (por ejemplo, en el marco de un así llamado panel de diagnóstico o pronóstico específico para tumores) . En vista de la presión de los costes en el ámbito de la sanidad, estos exámenes deben ser realizados de la manera más efectiva en cuanto al tiempo y los costes implicados.

Para la realización de tales análisis tisulares se han propuesto dispositivos de coloración automáticos (también denominados como dispositivos stainer) .

En tal sentido, en el documento US 6.495.106 se describe un dispositivo de coloración automático que tiene un brazo móvil en tres dimensiones, que a su vez lleva un cabezal provisto de una escotadura. Este cabezal comprende un cabezal de reactivos con una punta que sirve para aplicar los reactivos. El cabezal comprende además una punta de lavado y una punta de soplado, para poder efectuar las diferentes etapas de una reacción de comprobación típica.

Un dispositivo similar se describe también en el documento US 5.948.359, en donde el cabezal de reactivos puede ser provisto de puntas de pipetas de un solo uso para la aplicación de los reactivos, que se mantienen preparadas en un dispositivo de soporte correspondiente.

Estos dispositivos son menos apropiados para efectuar reacciones de comprobación en una pluralidad de portaobjetos, que respectivamente presentan una pluralidad de zonas de reacción apropiadas para muestras celulares o tisulares, debido a que el análisis en total requeriría un período de tiempo muy largo, ya que sólo se dispone de una punta de reactivos. Adicionalmente, por razonamientos diagnósticos existe una gran demanda de poder realizar para un paciente determinado una pluralidad de análisis en muestras tisulares del mismo tejido, a fin de poder establecer y verificar un diagnóstico de acuerdo con el procedimiento algorítmico previamente... [Seguir leyendo]

1. Cabezal de dosificación (30) para el uso en un dispositivo de coloración automático (10) para exámenes en serie en el ámbito de la sanidad para la dosificación de reactivos sobre una pluralidad de portaobjetos (50) , que 5 comprende una pluralidad de depósitos de almacenamiento (31) que son apropiados para recibir reactivos líquidos y que en un extremo presentan una válvula de dosificación (33) para la dosificación y aplicación de los reactivos sobre los portaobjetos (50) , en donde los depósitos de almacenamiento (31) presentan una cubierta (32) en el extremo opuesto a las válvulas de dosificación (33) y el cabezal de dosificación (30) está formado por placas o bloques sustituibles, en donde la cubiertas (32) , los depósitos de almacenamiento (31) y/o las válvulas de dosificación (33)

forman respectivamente un bloque unido en forma de unidad, caracterizado por que la cubierta (32) es una cubierta hermética al gas (32) , en donde la cubierta (32) presenta una conexión provista de válvulas de entrada para la aplicación de una sobrepresión de gas y el volumen medio de los depósitos de almacenamiento (31) es de por lo menos 2, 5 ml.

2. Cabezal de dosificación de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la salida de descarga de las válvulas de dosificación (33) está dispuesta encima de los agujeros de una placa perforada.

3. Cabezal de dosificación de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 o 2, en donde el cabezal de dosificación (30) presenta un control de dosificación para medir el volumen de los reactivos dosificados, estando el control de dosificación preferentemente formado por sensores de flujo ópticos (34) o por un sistema de medición de flujo capacitivo.

4. Cabezal de dosificación acuerdo con la reivindicación 3, en donde los sensores de flujo (34) están configurados como un bloque unido en forma de unidad. 25

5. Cabezal de dosificación de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el cabezal de dosificación presenta un soporte para recibir conductos de líquido y, en particular, conductos de reactivos de comprobación tales como reactivos secundarios y/o terciarios, presentando el soporte preferentemente válvulas de dosificación y/o un control de dosificación.

6. Cabezal de dosificación de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, en donde uno o varios cabezales de dosificación (30) están configurados de tal manera que pueden ser insertados de manera removible en un soporte de cabezal de dosificación (40) del dispositivo automático (10) para la dosificación de reactivos sobre una pluralidad de portaobjetos (50) .

7. Cabezal de dosificación de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el cabezal de dosificación comprende un dispositivo lector para elementos de identificación fijados sobre los portaobjetos (50) .

8. Dispositivo de coloración automático (10) para exámenes en serie en el ámbito de la sanidad para la dosificación

de reactivos sobre una pluralidad de portaobjetos (50) , que comprende dispositivos de soporte para una pluralidad de portaobjetos (50) , que en cada caso comprenden una pluralidad de depresiones delimitadas entre sí (52) que son apropiadas para recibir muestras celulares o tisulares (53) , un cabezal de dosificación (30) de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7 con una pluralidad de depósitos de almacenamiento (31) , que son apropiados para recibir reactivos líquidos y que en el extremo orientado hacia las 45 depresiones (52) presentan una válvula de dosificación (33) para la dosificación y aplicación de reactivos en las depresiones (52) , y un dispositivo de posicionamiento (14) para posicionar los dispositivos de almacenamiento (31) del cabezal de dosificación (30) sobre las respectivas depresiones (52) de los portaobjetos (50) .

9. Dispositivo de acuerdo con la reivindicación 8, en donde los portaobjetos (50) están dispuestos de manera removible sobre una o varias bandejas (51) .

10. Dispositivo de acuerdo con las reivindicaciones 8 o 9, en donde las bandejas (51) pueden ser colocadas de manera removible en el dispositivo (10) . 55

11. Dispositivo de acuerdo con una de las reivindicaciones 8 a 10, en donde los depósitos de almacenamiento (31) están dimensionados de tal manera que por lo menos tres, preferentemente seis depresiones adyacentes (52) pueden ser cargadas simultáneamente desde depósitos de almacenamiento (31) con reactivos de comprobación.

12. Dispositivo de acuerdo con una de las reivindicaciones 8 a 11, en donde la salida de descarga de las válvulas de dosificación (33) están dispuestas sobre los agujeros de una placa perforada.

13. Dispositivo de acuerdo con una de las reivindicaciones 8 a 12, en donde el cabezal de dosificación (30)

comprende sensores de flujo (34) para medir el volumen de los reactivos dosificados. 65

14. Dispositivo de acuerdo con una de las reivindicaciones 8 a 13, en donde el dispositivo (10) comprende un soporte de cabezal de dosificación (40) , en el que se pueden insertar uno o varios cabezales de dosificación (30) .

15. Dispositivo de acuerdo con una de las reivindicaciones 8 a 14, en donde el dispositivo (10) comprende una cubeta de lavado dispuesta debajo de los portaobjetos (50) para recibir un líquido de lavado.

16. Dispositivo de acuerdo con una de las reivindicaciones 8 a 15, en donde un portaobjetos (50) de manera individual o conjuntamente con otros portaobjetos (50) puede ser transferido desde una primera posición apropiada para la incorporación de los reactivos en la depresión (52) a una segunda posición ubicada dentro de la cubeta de lavado.

17. Dispositivo de acuerdo con la reivindicación 16, en donde la bandeja (51) que soporta los portaobjetos de manera individual o conjuntamente con otras bandejas (51) puede ser transferida desde una primera posición apropiada para efectuar las reacciones de comprobación a una segunda posición dentro de la cubeta de lavado.

18. Dispositivo de acuerdo con una de las reivindicaciones 8 a 17, en donde el dispositivo (10) presenta una estación de carga preferentemente automática, a la que puede ser desplazado por medio del dispositivo de posicionamiento

(14) el cabezal de dosificación (30) con los depósitos de almacenamiento (31) parcialmente o completamente vacíos, para recargar los depósitos de almacenamiento (31) con los respectivos reactivos.

19. Procedimiento para la dosificación de reactivos sobre una pluralidad de portaobjetos (50) , en donde se usa un dispositivo de coloración automático (10) para exámenes en serie en el ámbito de la sanidad de acuerdo con una de las reivindicaciones 8 a 18, en el que los portaobjetos (50) se colocan en el dispositivo (10) , los depósitos de almacenamiento (31) , que están configurados como un bloque unido en forma de unidad y en el extremo opuesto a las válvulas de dosificación (33) presentan la cubierta hermética al gas (32) , en donde la cubierta (32) presenta una conexión provista de válvulas de entrada para la aplicación de una sobrepresión de gas, se llenan con reactivos, el cabezal de dosificación (30) con ayuda del dispositivo de posicionamiento (14) posiciona depósitos de almacenamiento mutuamente adyacentes (31) sobre por lo menos tres depresiones adyacentes (52) del portaobjetos (50) , y los reactivos se dosifican dentro de las depresiones (52) , en donde el volumen del reactivo es menor que el volumen de la depresión (52) y en donde por lo menos tres depresiones adyacentes (52) de los portaobjetos (52) son cargados simultáneamente con reactivos desde los depósitos de almacenamiento (31) .

20. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 19, en el que los portaobjetos (52) están marcados con elementos de identificación y el cabezal de dosificación (30) o el soporte de cabezal de dosificación (40) del dispositivo comprenden un aparato lector para leer los elementos de identificación, en donde el cabezal de dosificación (30) recorre los portaobjetos (50) antes de comenzar la dosificación de los reactivos, para leer la información en los medios de identificación y para detectar la posición de los portaobjetos (50) y de las depresiones (52) provistas en los portaobjetos (50) .