Moléculas bifuncionales para inhibir la entrada del HIV.

Una molécula bifuncional constituida por:

una primera secuencia de aminoácidos que comprende un primer péptido de repetición de heptada Cterminal (CHR) del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) gp41 que contiene un dominio de fijación de bolsa y un dominio de fijación de repetición de heptada (HR) enlazado a;

un enlazador flexible constituido por la secuencia de aminoácidos (GGGGS)n, en donde n es un número entero de 6 ó 7, que está enlazado a su vez a;

una segunda secuencia de aminoácidos que comprende un segundo péptido CHR gp41 de HIV que contiene un dominio de fijación de HR y un dominio rico en triptófano;

10 en donde dicha molécula bifuncional comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de: 2. La molécula bifuncional de la reivindicación 1, en donde la molécula bifuncional.

Molïculas bifuncionales para inhibir la entrada del HIV

Campo de la Invenciïn La presente descripciïn se refiere al campo de los agentes anti-virales. Especïficamente, la presente descripciïn se 5 refiere a agentes anti-virales que comprenden molïculas bifuncionales que inhiben la entrada del virus de la inmunodeficiencia humana en cïlulas diana.

Antecedentes de la Invenciïn A finales de 2007, aproximadamente 33, 2 millones de personas en el mundo vivïan infectadas con el Virus de la Inmunodeficiencia Humana (HIV) y mïs de 25 millones de personas habïan muerto a consecuencia del sïndrome de 10 inmunodeficiencia adquirida (SIDA) . Por tanto, es urgentemente necesario descubrir y desarrollar nuevas estrategias terapïuticas contra la infecciïn de HIV. Hasta ahora, han sido aprobados 28 fïrmacos anti-HIV por la Administraciïn de Alimentos y Fïrmacos de los Estados Unidos a fin de tratar las personas infectadas con HIV, que incluyen 15 inhibidores de la transcriptasa inversa (RTIs) , 10 inhibidores de proteasas (PIs) , un inhibidor de integrasa (II) , y dos inhibidores de entrada (EIs) . La totalidad de los RTIs, PIs, e II inhiben la replicaciïn del HIV despuïs que el virus entra en las cïlulas hospedadoras, mientras que los dos EIs pueden bloquear la entrada del HIV en la cïlula hospedadora.

La entrada del HIV se inicia por fijaciïn de la subunidad de superficie de la glicoproteïna de la envoltura (Env) gp120 al receptor primario CD4 y luego a un receptor de quimioquinas (CCR5 o CXCR4) en la cïlula diana. Estas interacciones desencadenan el reordenamiento estructural de gp41, dando como resultado la formaciïn de una 20 estructura de nïcleo estable en haz de 6 hïlices (6-HB) de gp41 que pone ambas membranas viral y de la cïlula diana en proximidad para fusiïn. En el 6-HB, tres repeticiones de heptada N-terminales (NHR o HR1) se asocian para formar el serpentïn enrollado trïmero central, mientras que tres repeticiones de heptada C-terminales (NHR o HR2) se empaquetan oblicuamente de una manera anti-paralela en las hendiduras hidrïfobas altamente conservadas de la superficie del trïmero NHR. En cada hendidura, existe una bolsa hidrïfoba profunda altamente conservada formada por la secuencia formadora de bolsa (residuos 565-581) en la regiïn NHR. Esta bolsa juega un papel crïtico en la fusiïn viral y en el mantenimiento de la estabilidad de la 6-HB.

Uno de los EIs aprobados por la FDA es un pïptido sintïtico diseïado sobre la base de la secuencia CHR gp41 de HIV-1 (aa 638-673) , denominado T20 (nombre genïrico: enfuvirtida, nombre de marca: Fuzeonï [Trimeris]) . T20 contiene un dominio de fijaciïn HR (de repeticiïn de heptada) (HBD) y un dominio rico en triptïfano (TRD) (Fig. 1) , a travïs del cual T20 puede fijarse a la secuencia HR, especialmente el motivo GIV en NHR, y la membrana de la cïlula diana, respectivamente, para inhibir la fusiïn de HIV con la cïlula diana y la entrada en ella.

La clïnica de la aplicaciïn de T20 es limitada debido a la rïpida apariciïn de virus resistentes a T20 en los pacientes tratados con T20. Estudios tanto in vitro como in vivo han demostrado que la resistencia a T20 estï asociada con mutaciones simples o dobles en el GIV y la regiïn adyacente (aa 36-45) en el dominio NHR de gp41 (v.g., G36D, 35 I37V, V38A, V38E, V38M, N42D, N42S y N43D) debido a que esta regiïn es el sitio de fijaciïn primario en gp41 y estas mutaciones impactan en la fijaciïn de T20 a la regiïn NHR de gp41 viral. Dado que la fijaciïn de T20 a la secuencia HR en el dominio NHR no es suficientemente fuerte para competir con la interacciïn entre las regiones CHR y NHR de gp41 virales, T20 tiene que utilizar su TRD C-terminal para interaccionar con la membrana de la cïlula diana a fin de estabilizar su interacciïn con la regiïn NHR de gp41 viral. Otro punto dïbil del pïptido T20

como fïrmaco anti-HIV es que el mismo tiene que administrarse por inyecciïn dos veces al dïa a dosis alta (90 mg/dosis) , dando como resultado reacciones dolorosas en el sitio de inyecciïn en la mayorïa de los pacientes. Adicionalmente, debido al alto coste de producciïn de la sïntesis de pïptidos, T20 es exorbitantemente caro para utilizaciïn, especialmente en los païses en desarrollo.

C38 es un pïptido 38-mero derivado de los aa 626-673 de la. El mismo contiene un dominio de fijaciïn de bolsa 45 (PBD) un HBD (Fig. 1) , a travïs del cual C38 se fija a la secuencia formadora de bolsa y la secuencia HR en la regiïn NHR de gp41 viral para formar 6-HB heterïlogo estable y bloquear la formaciïn del nïcleo gp41 activo de fusiïn. Esto da como resultado la inhibiciïn de la fusiïn de HIV con la cïlula hospedadora, y la entrada en ella. Dado que el sitio de fijaciïn primario de C38 es la secuencia formadora de bolsa, en lugar de la regiïn de aminoïcidos 3645, las mutaciones en el motivo GIV y la regiïn adyacente en el T1144 del dominio NHR de gp41 no afectan 50 significativamente a la fijaciïn de C38. Por tanto, los virus con mutaciones en los aminoïcidos 36-45 son resistentes a T20, pero sensibles a C38.

T1144 es tambiïn un pïptido 38-mero que contiene un PBD y un HBD (Fig. 1) . El mismo fue diseïado por modificaciïn de la secuencia de aminoïcidos de C38 a fin de aumentar la helicidad α y la estabilidad de 6-HB y mejorar las propiedades farmacocinïticas. Como C38, T1144 es mucho mïs eficaz que T20 contra ambas cepas R5

y X4 de HIV-1, con inclusiïn de las resistentes a T20.

Un estudio reciente ha demostrado que la combinaciïn de un pïptido CHR que contiene el PBDn (v.g., C34, C38, T1144) y un pïptido CHR que carece del PBD (v.g., T20) exhibe un efecto sinïrgico potente contra ambos virus sensibles y resistentes a T20.

WO 2005/007831 da a conocer un mimïtico de proteïna para prevenciïn de la entrada de HIV-1 en cïlulas 5 hospedadoras que comprende al menos dos cadenas monïmeras y un enlazador intercatenario que acopla las cadenas monïmeras.

Breve Descripciïn De Los Dibujos FIG. 1 representa el diseïo del inhibidor de entrada bifuncional de HIV, una vista esquemïtica de la molïcula gp41 de HIV-1HXB2 y secuencias de inhibidores de entrada de HIV ilustrativos. FP, pïptido de fusiïn; NHR, repeticiïn de 10 heptada N-terminal; CHR, repeticiïn de heptada C-terminal, TR, dominio rico en triptïfano; TM, dominio transmembranal; CP, dominio citoplïsmico. PBD (dominio de fijaciïn de bolsa) ; HBD (dominio de fijaciïn de la repeticiïn de heptada) , y TRD (dominio rico en triptïfano) en los pïptidos CHR estïn resaltados en negrita, cursiva y subrayado, respectivamente. La secuencia de repeticiïn de heptada (HR) , el motivo GIV (determinante para la resistencia a T20) , y la secuencia de formaciïn de bolsa en la NHR estïn resaltadas en subrayado, negrita y cursiva,

respectivamente.

FIG. 2 representa la interacciïn entre los pïptidos NHR y CHR. Las lïneas entre los dominios NHR y CHR indican la interacciïn entre los residuos localizados en las posiciones e, g y a, d en las NHR y CHR, respectivamente. La interacciïn entre el PBD y la secuencia formadora de bolsa es crïtica para la estabilizaciïn del haz 6-helicoidal (6-HB) .

FIG. 3 representa el anïlisis SDS-PAGE de los inhibidores de entrada del HIV purificados.

FIG. 4 representa la inhibiciïn por los inhibidores de entrada del HIV de la fusiïn cïlula-cïlula mediada por HIV-1 como se determina por ensayo de transferencia de tinte.

FIG. 5 representa la inhibiciïn por los inhibidores de entrada de HIV de la infecciïn por una cepa IIIB de HIV-1 adaptada en laboratorio (subtipo B, X4) en cïlulas MT-2 como se determina por el ensayo p24.

FIG. 6 representa la inhibiciïn por los inhibidores de entrada de HIV por aislados primarios de HIV-1. FIG. 6A inhibiciïn de la infecciïn por 92US657 primario de HIV-1 (subtipo B, R5) en PBMCs como se determina por el ensayo p24. FIG. 6B - inhibiciïn de la infecciïn por el aislado 93IN101 primario de HIV-1 (subtipo C, R5) en PBMCs como se determina por el ensayo p24.

FIG. 7 representa la inhibiciïn por los inhibidores de entrada de HIV de la infecciïn por la cepa de HIV-1 resistente a 30 T20, NL4-3V38A/N42G.

FIG. 8 representa la estabilidad de TLT-1 en sueros humanos (FIG. 8A) y en cultivos de PBMC (FIG. 8B) .

FIG. 9 representa la sensibilidad de TLT-1 a las enzimas proteolïticas proteinasa K (FIG. 9A) y tripsina (FIG. 9B) . Cada muestra se testï por triplicado. Cada experimento se repitiï al menos una vez y un conjunto de datos representativo se presenta en valor medio ï SD.

FIG. 10 representa la estructura secundaria de TLT-1, como se determina por dicroïsmo circular (CD) , y su capacidad para formar 6-HB con pïptidos NHR. FIG. 10A - espectros... [Seguir leyendo]

1. Una molïcula bifuncional constituida por:

una primera secuencia de aminoïcidos que comprende un primer pïptido de repeticiïn de heptada Cterminal (CHR) del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) gp41 que contiene un dominio de fijaciïn de bolsa y 5 un dominio de fijaciïn de repeticiïn de heptada (HR) enlazado a;

un enlazador flexible constituido por la secuencia de aminoïcidos (GGGGS) n, en donde n es un nïmero entero de 6 ï 7, que estï enlazado a su vez a;

una segunda secuencia de aminoïcidos que comprende un segundo pïptido CHR gp41 de HIV que contiene un dominio de fijaciïn de HR y un dominio rico en triptïfano;

en donde dicha molïcula bifuncional comprende una secuencia de aminoïcidos seleccionada de:

2. La molïcula bifuncional de la reivindicaciïn 1, en donde la molïcula bifuncional se produce por tecnologïa de DNA recombinante.

3. La molïcula bifuncional de la reivindicaciïn 1, en donde dicha molïcula bifuncional se produce en un sistema 15 de expresiïn seleccionado de bacterias, levaduras, cïlulas de insecto y cïlulas de mamïfero.

4. La molïcula bifuncional de la reivindicaciïn 3, en donde dicha molïcula bifuncional se produce en Escherichia coli.

5. La molïcula bifuncional de la reivindicaciïn 1, en donde dicha molïcula bifuncional se sintetiza sobre un sïlido o en soluciïn.

6. La molïcula bifuncional de la reivindicaciïn 1, en donde dicha molïcula bifuncional se sintetiza como varios segmentos separados que se conectan luego unos con otros.

7. La molïcula bifuncional de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para uso en el tratamiento o la prevenciïn de la infecciïn del Virus de la Inmunodeficiencia Humana (HIV) .

8. Una composiciïn farmacïutica que comprende la molïcula bifuncional conforme a una cualquiera de las 25reivindicaciones 1 a 7 y un vehïculo farmacïuticamente aceptable.

FIG. 1