Métodos para dispersar embriones vegetales somáticos.

Un método de dispersión de grupos de embriones vegetales suspendidos en un líquido en embriones vegetales individuales,

incluyendo dicho método al menos una secuencia de dispersión, que comprende las siguientes etapas:

i) someter los grupos de embriones a fuerzas de dinámica de fluidos que provocan deformación de extensión axial y deformación de compresión radial;

ii) someter los grupos de embriones a fuerzas de dinámica de fluidos que provocan deformación de compresión axial y deformación de extensión radial de fuerzas de dinámica de fluidos; repetir dichas etapas en secuencia hasta que los embriones individuales se separan entre sí.

Métodos para dispersar embriones vegetales somáticos Antecedentes de la invención Introducción general al área problemática

La embriogénesis somática en plantas es un proceso en el que se forman embriones somáticos a partir de un explante inicial que es una célula en un tejido vegetal. Los embriones somáticos formados son copias genéticamente idénticas de la planta que proporciona el explante inicial. El proceso de embriogénesis somática ofrece por lo tanto una herramienta para obtener grandes números de plantas genotípicamente idénticas para multiplicación de genotipos seleccionados de interés comercial, para conservación de especies en peligro o para generar material vegetal genéticamente uniforme para fines de investigación.

Antecedentes fisiológicos de los procedimientos relacionados con el problema

Para producir plantas de embriones somáticos de coniferas, se aplica un procedimiento multietapa para cumplir las necesidades fisiológicas de los diferentes estadios de desarrollo como se describe posteriormente y se muestra en la Figura 1. El inicio de la embriogénesis somática comienza con la inducción de embriones somáticos a partir de un explante inicial, normalmente un embrión cigótico inmaduro, en un medio de cultivo solidificado que contiene un regulador del crecimiento de la planta. Los embriones somáticos continúan formándose, normalmente en el mismo medio de cultivo de composición, y una forma de cultivo embriogénica en proliferación. En el estadio de proliferación, tienen lugar vahos de los elementos clave generalmente considerados beneficiosos para el proceso de embriogénesis somática: (i) la propagación en masa de propágulos genotípicamente idénticos a través de multiplicación ilimitada de embriones somáticos inmaduros; (ii) el almacenamiento criogénico de embriones en proliferación confirma un almacenamiento prácticamente eterno de clones, es decir, se establece un banco de clones, (iii) la modificación transgénica del embrión somático inmaduro permite la propagación a gran escala de propágulos mejorados genéticamente. En la siguiente etapa en el procedimiento, el embrión somático en proliferación se somete a un medio de crecimiento que desencadena desarrollo embrionario para progresar al estadio de maduración. La conversión de proliferación a maduración solamente se produce en una fracción de los embriones en proliferación en el cultivo. Se encuentran bajas tasas de conversión más frecuentemente en genotipos de especies coniferas recalcitrantes, pero son comunes en todas las especies de coniferas así como otras especies vegetales. El trabajo manual necesario para recoger embriones aumenta con la traducción de la tasa de conversión, y por lo tanto el coste y riesgo de contaminación y otras imprecisiones. La baja tasa de conversión de proliferación a maduración es un obstáculo importante para aplicaciones comerciales a gran escala de procedimientos de embriogénesis somática. Para la germinación, se someten embriones somáticos maduros a diferentes regímenes de cultivo para inducir la formación de raíz y brotes, en varias etapas diferentes; desecación, tratamiento con sacarosa, inducción con luz roja y estimulación con luz azul. A continuación, los embriones germinados que se considera que se han desarrollado de forma apropiada se transfieren a un material fertilizante y se transfieren gradualmente a un ambiente ex vitro durante el que se reduce el contenido de sacarosa. Los diferentes tratamientos durante la germinación en una planta requieren manipulación manual repetida de germinantes individuales y plantas lo que añade un coste considerable al procedimiento general.

Producción de plantas a partir de embriones somáticos

El procedimiento de la técnica anterior para producir plantas a partir de embriones somáticos requiere la manipulación manual en varias etapas haciendo el procedimiento largo, caro e impreciso.

Para especies de coniferas, los procedimientos convencionales usados implican varias etapas cuando se requiere manipulación manual. El procedimiento general se perfila en la Figura 1 (véase, por ejemplo, von Arnold S, ClaphamD. Spruce embryogenesis. 28. Methods Mol Biol. 28; 427: 31-47; Belmonte M F, Donald G, Reid D M, Yeung E C y Stasolla C. 25. Alterations of the glutathione redox State improve apical meristem structure and somatic embryo quality in white spruce (Picea glauca). J Exp Bot, Vol. 56, N2 419, pp. 2355-2364).

Hay cuatro etapas que se basan en la manipulación manual para obtener una planta pequeña a partir del embrión somático maduro como se ve en la Figura 1. La primera interacción manual es cuando [1] el embrión maduro se aísla de embriones inmaduros (12), y se coloca horizontalmente en un recipiente de plástico en condiciones estériles; la segunda [2] se produce después de 3-7 días de reposo (13), después el embrión maduro se transfiere a un medio de cultivo gelificado para el inicio de los procesos de germinación. El embrión somático germinado iniciará las raíces en condiciones de composición del medio de cultivo y luz apropiadas (14). La tercera transferencia manual [3] es cuando el germinante que tiene una raíz pequeña formada se transfiere a una posición vertical con la raíz parcialmente sumergida en el medio de generación líquido (15). La cuarta [4] y última transferencia es cuando los embriones germinados tienen una raíz columnar y raíces pequeñas laterales, después se transfiere a un sustrato sólido en una maceta para formación vegetal adicional (16).

Tabla 1. Lista de designaciones concernientes a la Figura 1.

La conversión de proliferación a maduración solamente se produce en una fracción de los embriones en proliferación en el cultivo. Se encuentran bajas tasas de conversión más frecuentemente genotipos de especies de coniferas recalcitrantes, pero son habituales en todas las especies de coniferas así como en otras especies vegetales. El trabajo manual necesario para recoger embriones aumenta con la reducción de la tasa de conversión, y de este modo el coste y el riesgo de contaminación y otras imprecisiones. La baja tasa de conversión de proliferación a maduración es un obstáculo importante para aplicaciones comerciales a gran escala de procedimientos de embriogénesis somática. Para germinación, los embriones somáticos maduros se someten a diferentes regímenes de cultivo para inducir la formación de raíz y brotes, en varias etapas diferentes; desecación, tratamiento con sacarosa, inducción con luz roja y estimulación con luz azul. A continuación, los embriones germinados que se considera que están desarrollados de forma apropiada se transfieren a un material fertilizante y se transfieren gradualmente a un ambiente ex vitro durante el que se reduce el contenido en sacarosa. Los diferentes tratamientos durante la germinación en una planta requieren manipulación manual repetida de germinantes individuales y plantas añadiendo un coste considerable al procedimiento general.

En el método disponible hasta la fecha para producir plantas a partir de embriones somáticos los embriones se seleccionan manualmente del tejido embriogénico inmaduro. Esto consume tiempo y es ineficaz. Sería por lo tanto deseable proporcionar un modo de realizar la separación de los embriones más eficaz. Los embriones somáticos producidos inicialmente se pegan entre sí por tejido embriogénico inmaduro en grupos. Es un objetivo de la invención proporcionar medios eficaces para producir embriones vegetales somáticos, un medio automático para dispersar suavemente los grupos de embriones somáticos en embriones individuales separados del tejido embriogénico. La invención se refiere a un método para dicha dispersión.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a métodos para dispersar suavemente grupos de embriones vegetales somáticos en embriones individuales y tejido embriogénico inmaduro.

Se desvela un método de dispersión de grupos de embriones vegetales... [Seguir leyendo]

1. Un método de dispersión de grupos de embriones vegetales suspendidos en un líquido en embriones vegetales individuales, incluyendo dicho método al menos una secuencia de dispersión, que comprende las siguientes etapas:

i) someter los grupos de embriones a fuerzas de dinámica de fluidos que provocan deformación de extensión axial y deformación de compresión radial;

ii) someter los grupos de embriones a fuerzas de dinámica de fluidos que provocan deformación de compresión axial y deformación de extensión radial de fuerzas de dinámica de fluidos; repetir dichas etapas en secuencia hasta que los embriones individuales se separan entre sí.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la fuerza de las deformaciones de extensión y de compresión aumenta con cada secuencia repetida.

3. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las etapas i) y ii) se realizan usando un dispersador para separar embriones individuales contenidos en grupos de embriones, caracterizado por que el dispersador comprende un canal de flujo que incluye al menos una constricción, de modo que los grupos de embriones que fluyen a través del canal de flujo se someten en primer lugar a deformación de extensión axial y deformación de compresión radial, y después a deformación de compresión axial y deformación de extensión radial de fuerzas de dinámica de fluidos.

4. El método de la reivindicación 3, en el que el dispersador para separar embriones vegetales somáticos individuales contenidos en grupos de embriones se caracteriza por que comprende un canal de flujo que incluye 3- 1 constricciones,

en el que el canal de flujo incluye una parte intermedia que tiene una sección transversal esencialmente constante, entre cada constricción, que tiene longitud de al menos 2,5 mm,

en el que las constricciones tienen un área de sección transversal en el intervalo de ,75 a 13 mm2 a condición de que la dimensión de sección transversal mínima del canal de flujo sea mayor que la dimensión mayor del embrión mayor que hay que dispersar,

de modo que los grupos de embriones que fluyen a través del canal de flujo se someten en primer lugar a deformación de extensión axial y deformación de compresión radial, y después a deformación de compresión axial y deformación de extensión radial de fuerzas de dinámica de fluidos.

5. El método de la reivindicación 4, en el que cada parte intermedia tiene un diámetro interno, que es igual a o menor que el diámetro interno de la parte intermedia inmediatamente corriente arriba de la misma.

6. El método de las reivindicaciones 4-5, en el que cada parte intermedia tiene una longitud al menos igual a los grupos de embriones para dispersar.

7. El método de la reivindicación 6, en el que la longitud de cada parte intermedia está en el intervalo de 2,5 mm a 6 mm, preferentemente de aproximadamente 5 mm a aproximadamente 3 mm.

8. El método de las reivindicaciones 4-7, en el que el número de constricciones es 5-2, más preferentemente aproximadamente 1.

9. El método de las reivindicaciones 4-8, en el que la constricción tiene un área de sección transversal en el intervalo de 3 a 32 mm2.

1. El método de cualquiera de las reivindicaciones 4-9, en el que el canal de flujo tiene sección transversal axisimétrica.

11. El método de las reivindicaciones 4-9, en el que el canal de flujo tiene una sección transversal esencialmente circular u oval.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 4-9, en el que al menos parte del canal de flujo tiene una sección transversal no axisimétrica tal como una sección transversal rectangular.

13. El método de la reivindicación 12, en el que la sección transversal de cada constricción no axisimétrica, que tiene una dimensión máxima, se orienta de modo que la dimensión máxima de cada constricción está girada al menos 32, preferentemente aproximadamente 9a en relación con la dimensión máxima de la siguiente constricción no axisimétrica en secuencia.

14. El método de la reivindicación 12, en el que la sección transversal de cada constricción representa un rectángulo, que tiene un primer y un segundo lados, en donde el primer lado es más largo que el segundo lado, y las constricciones se orientan de tal manera que el primer lado de cada constricción es perpendicular al primer lado de la siguiente constricción en secuencia que tiene una sección transversal rectangular.