Método de extracción eficaz de proteínas a partir de células.

Un método para producir un extracto de proteínas a partir de células fijadas o sin fijar,

que comprende:

(a) poner en contacto dichas células con un reactivo de extracción para producir una composición intermedia que tenga un pH mayor de pH 10,0; y

(b) poner en contacto dicha composición intermedia con un reactivo de neutralización para reducir dicho pH de dicha composición intermedia y producir dicho extracto de proteínas,

en el que uno o ambos de dicho reactivo de extracción y dicho reactivo de neutralización comprenden un alquil éter de polioxietileno.

Método de extracción eficaz de proteínas a partir de células

Antecedentes de la invención En muchos métodos de diagnóstico, se toman células de un sujeto y se depositan en un medio líquido que contiene un fijador. Las células se fijan en el medio y se examinan citológicamente para proporcionar un diagnóstico. Por ejemplo, la detección de células precancerosas o cancerosas en tejidos del cuello uterino se realiza habitualmente 10 mediante evaluación microscópica de células exfoliadas del cuello uterino. Este método, desarrollado por George N. Papanicolaou y conocido como el ensayo de "Pap", implica exfoliar células a partir del cuello uterino de una mujer usando un dispositivo de muestreo, depositar las células exfoliadas en un medio de transporte que contiene un fijador, y a continuación depositar las células en un portaobjetos. A continuación, las células se tiñen y las anomalías celulares son examinadas por un profesional médico capacitado mediante microscopía de luz. Solamente en los Estados Unidos cada año se realizan más de 55 millones de ensayos de Pap.

A pesar del éxito de dichos ensayos citológicos, los ensayos son propensos al error. Por ejemplo, se ha estimado que hasta un 40 % de los ensayos convencionales de Pap se ven comprometidos por la presencia de contaminantes tales como glucosa, células sanguíneas y células inflamatorias de ocultación. Estos contaminantes conducen a resultados de falso negativo, asustados de falso positivo, y una cantidad significativa de trabajo de seguimiento. Véase, por ejemplo, Koss, L. G. (1989) , The Papanicolaou Test for Cervical Cancer Detection: A Triumph and a Tragedy, JAMA 261: 737-743; véase también DeMay, "Problems in Pap Smear Interpretation", Arch. Pathol. Lab. Med. 121: 229-23 (1997) .

En vista de lo anterior, existe una necesidad de métodos de diagnóstico molecular complementarios para el análisis de células que están presentes en un medio líquido que contiene un fijador. Sin embargo, dichos métodos no son sencillos debido a que no siempre es posible realizar dichos métodos en células fijadas. Por ejemplo, determinados fijadores (por ejemplo, los medios de transporte usados en sistemas de ensayo como THINPREP™ o SUREPATH™) pueden hacer que proteínas celulares en particular precipiten o se agreguen, haciendo de este modo que estas proteínas sean insolubles y difíciles o imposibles de detectar de forma fiable usando medios convencionales, por ejemplo, usando un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) u otro ensayo inmunológico.

El documento WO0057906 desvela el desensamblaje de VLP del VPH con un tampón que tiene un pH de 7, 0 a 10,

preferentemente pH 8, 0 y puede comprender un alquil éter de polioxietileno (pero preferentemente comprende Polisorbato 80) , tras lo cual el pH se reduce.

El documento EP0363110 desvela un método para extraer antígenos del herpes, clamidia, y gonococos usando un pH elevado, es decir un pH de al menos 10. Después de la extracción, se añade un reactivo de neutralización.

Por lo tanto, existe una gran necesidad de métodos y composiciones para extraer proteínas a partir de células fijadas y sin fijar de una manera que les permita que sean adecuadas para su uso en ensayos de detección molecular, por ejemplo, inmunológicos. La invención que se describe en el presente documento satisface esta necesidad, y otras.

Sumario de la invención Se proporcionan métodos para producir un extracto de proteínas a partir de células. En términos generales, los métodos implican: poner en contacto una muestra celular con un reactivo de extracción de pH elevado (mayor de pH 10) que comprende un alquil éter de polioxietileno (por ejemplo, Brij™35) para producir una composición intermedia 50 que tiene un pH de pH 10, 0 y a continuación, en presencia de un reactivo de neutralización, neutralizar el pH de la composición intermedia, por ejemplo, a un valor de pH de aproximadamente 6-9, opcionalmente a un valor de pH de 7-8, 5, para producir el extracto de proteínas. Uno o ambos del reactivo de extracción y el reactivo de neutralización contiene un alquil éter de polioxietileno. Las células pueden ser células de cuello uterino que exfoliadas fijadas o sin fijar. En determinadas realizaciones, los métodos implican extraer una proteína viral diana tal como una proteína E6 55 del VPH a partir de una muestra celular. Determinadas realizaciones también proporcionan métodos para detectar la presencia de una proteína, tal como una proteína viral diana, que comprende producir un extracto de proteínas a partir de células fijadas o sin fijar de acuerdo con el método que se ha descrito anteriormente y someter a ensayo la presencia de dicha proteína en dicho extracto de proteínas. Además, la invención proporciona un kit para producir un extracto de proteínas que comprende: un reactivo de extracción que tiene un pH mayor de pH 10, 0, y un reactivo de 60 neutralización en el que uno o ambos de dicho reactivo de extracción y dicho reactivo de neutralización comprende un alquil éter de polioxietileno tiene que dicho reactivo de extracción y agente de neutralización se pueden usar en el método que se ha descrito anteriormente para producir un extracto de proteínas adecuado para su uso en un ensayo de unión. Además, la invención proporciona un kit para producir un extracto de proteínas a partir de células fijadas o sin fijar. El kit puede comprender adicionalmente componentes y/o reactivos para detectar la proteína diana en el

extracto de proteínas.

Breve descripción de los dibujos La FIG. 1A demuestra el efecto sinérgico, en la detección de la proteína E6 extraída del VPH 16, del uso de un reactivo de extracción con un pH alto combinado con determinados aditivos. Se suspendió proteína E6 extraída del VPH 16 recombinante purificada previamente (MBP-E6) en reactivo de extracción y a continuación se neutralizó con reactivo de neutralización siguiendo el protocolo que se describe en el presente documento. La proteína E6 se capturó usando un ensayo de flujo lateral (LF) que se describe en el presente documento y se detectó con un lector de UMM. La FIG. 1B apoya que la introducción de aditivos en la etapa de neutralización no tuvo un efecto tan fuerte como la introducción durante la etapa de extracción en la detección de la proteína E6 extraída del VPH 16. La FIG. 2 demuestra la detección de proteína E6 del VPH 16 extraída a partir de células SiHa que expresan VPH 16 usando diversos aditivos en el reactivo de extracción. La FIG. 3 demuestra el efecto que tiene la valoración de la concentración celular sobre la detección de la proteína E6 extraída del VPH 16. Se usaron líneas celulares, dos positivas para VPH y una negativa para VPH.

La FIG. 4 demuestra la extracción de la proteína E6 del VPH 16 a partir de muestras clínicas negativas sin fijar con adiciones de células SiHa que expresan VPH 16. La FIG. 5 demuestra el efecto sobre la detección de la proteína E6 extraída del VPH 16 cuando la concentración de Brij™ 35 en el reactivo de extracción aumentan y cuando el Brij™ 35 se combina con otros detergentes no iónicos tales como Triton™ X-100 o Tween™-20. La FIG. 6 demuestra el efecto sobre la detección de la proteína E6 extraída del VPH 16 cuando se usan tiempos variables para extracción y/o neutralización. La FIG. 7 demuestra el uso de Brij™ 35 al 4 %/Tampón 2 a pH elevado para extracción de la proteína E6 derivada de las cepas del VPH 18 y 45. La FIG. 8 demuestra un efecto de dosis-respuesta en la detección de la proteína E6 derivada de las cepas del

VPH 16 y 18. La FIG. 9 demuestra la optimización adicional de la concentración de Brij™ 35 (con o sin otros aditivos no iónicos) en el reactivo de extracción. La FIG. 10 demuestra la optimización adicional de la concentración de Brij™ 35 (con o sin otros aditivos no iónicos) en el reactivo de extracción y el efecto en la extracción de la proteína E6 del VPH 16 a partir de muestras clínicas negativas sin fijar con adiciones de células que expresan el VPH. La FIG. 11 demuestra un formato de matriz de perlas citométricas (CBA) para detectar la proteína E6 del VPH 16 extraída a partir de células SiHa que expresan el VPH. La FIG. 12 demuestra el uso de Brij™ 35 al 4 %/Tampón 2 a pH elevado en la extracción de la proteína E6 del VPH 16 a partir de células fijadas o sin fijar.

La FIG. 13 demuestra que el citrato de la muestra a través de un filtro de jeringa de PVDF de 5, 0 mm de Millipore no disminuye significativamente la señal de la muestra.

Definiciones A menos que se indique de otro modo, todos los términos técnicos y científicos que se usan en el presente... [Seguir leyendo]

1. Un método para producir un extracto de proteínas a partir de células fijadas o sin fijar, que comprende:

(a) poner en contacto dichas células con un reactivo de extracción para producir una composición intermedia que tenga un pH mayor de pH 10, 0; y

(b) poner en contacto dicha composición intermedia con un reactivo de neutralización para reducir dicho pH de dicha composición intermedia y producir dicho extracto de proteínas,

en el que uno o ambos de dicho reactivo de extracción y dicho reactivo de neutralización comprenden un alquil éter de polioxietileno.

2. El método de la reivindicación 1, en donde dicho método comprende:

(a) poner en contacto dichas células con un reactivo de extracción para producir una composición intermedia que tiene un pH mayor de pH 10, 0, en donde dicho reactivo de extracción comprende un alquil éter de polioxietileno; y

(b) poner en contacto dicha composición intermedia con un reactivo de neutralización para reducir dicho pH de dicha composición intermedia y producir dicho extracto de proteínas a un pH de 6-9.

3. El método de la reivindicación 1, en donde dicho método comprende:

(a) poner en contacto dichas células con un reactivo de extracción para producir una composición intermedia que tenga un pH mayor de pH 10, 0; y

(b) poner en contacto dicha composición intermedia con un reactivo de neutralización para reducir dicho pH de dicha composición intermedia y producir dicho extracto de proteínas a un pH de 6-9, en donde dicho reactivo de neutralización comprende un alquil éter de polioxietileno.

4. El método de la reivindicación 1 para extraer una proteína viral diana a partir de una muestra celular que contiene células en las que una proteína viral diana está presente o se sospecha que está presente.

5. El método de la reivindicación 1 o de la reivindicación 4, en el que dicho alquil éter de polioxietileno es un tensioactivo Brij.

6. El método de la reivindicación 1, en el que dicho alquil éter de polioxietileno es Brij 35.

7. El método de la reivindicación 5, en el que el alquil éter de polioxietileno es Brij 35 y la concentración de dicho Brij 35 en el reactivo de extracción está dentro de un 2-6 % (v/v) .

8. El método de la reivindicación 7, en el que dicho reactivo de extracción comprende adicionalmente NaOH 0, 1 N, Citrato TriSórbico 50 mM, y tiene un pH de 12, 5 a 12, 9.

9. El método de la reivindicación 8, en el que dicho reactivo de extracción comprende adicionalmente detergente

Triton o detergente Tween, o mezcla de los mismos, opcionalmente detergente Triton X-100 o detergente Tween-20. 45

10. El método de la reivindicación 9, en el que la concentración de dicho detergente Triton X-100 o TWEEN-20 o ambos está dentro de un 1-6 % (v/v) .

11. El método de la reivindicación 1 o de la reivindicación 4, en el que el reactivo de neutralización es un tampón a base de Tris.

12. El método de la reivindicación 1, en el que las muestras se incuban:

(a) al menos 10 minutos después de la adición del reactivo de extracción, o 55 (b) entre 10 y 30 minutos después de la adición del reactivo de extracción, o

(c) al menos 10 minutos después de la adición del reactivo de neutralización, o

(d) entre 10 y 30 minutos después de la adición del reactivo de neutralización.

13. El método de la reivindicación 4, en el que las muestras se incuban:

(a) entre 10 y 30 minutos después de la adición del reactivo de extracción; o

(b) entre 10 y 30 minutos después de la adición del reactivo de neutralización.

14. El método de la reivindicación 5, en el que dicho tensioactivo Brij es uno o más de Brij 35, lauril éter de 65 polioxietileno (23) , CH3 (CH2) 10CH2 (OCH2CH2) nOH, n-23) ; Brij 30, lauril éter de polioxietileno (4) (CH3 (CH2) 10CH2 (OCH2CH2) nOH, n-4) ; Brij 52, cetil éter de polioxietileno (2) (C16H33 (OCH2CH2) nOH, n-2) ; Brij 56, cetil éter de polioxietileno (10) (C16H33 (OCH2CH2) nOH, n-10) ; Brij 58, cetil éter de polioxietileno (20) (C16H33 (OCH2CH2) nOH, n-20) ; Brij 72, estearil éter de polioxietileno (2) , (C18H37 (OCH2CH2) nOH, n-2) ; Brij 76, estearil éter de polioxietileno (10) (C18H37 (OCH2CH2) nOH, n-10) ; Brij 78, estearil éter de polioxietileno (20) (C18H37 (OCH2CH2) nOH, n ~ 20) ; Brij 92, oleil éter de polioxietileno (2) (C18H35 (OCH2CH2) nOH, n ~ 2) ; Brij 93, oleil éter

de polioxietileno (2) ; (C18H35 (OCH2CH2) nOH, n-2) ; Brij 97, oleil éter de polioxietileno (10) (C18H35 (OCH2CH2) nOH, n ~ 10) ; Brij 98, oleil éter de polioxietileno (20) (C18H35 (OCH2CH2) nOH, n ~ 20) ; Brij 700, estearil éter de polioxietileno (100) , (C18H37 (OCH2CH2) 21OH, n ~ 100) ; o Brij 721, estearil éter de polioxietileno (21) (C18H37 (OCH2CH2) nOH, n ~ 21) .

15. El método de la reivindicación 1, en el que:

dichas células fijadas o sin fijar están comprendidas en una muestra celular, en el que la muestra celular contiene opcionalmente células retiradas de un individuo, y en el que la muestra celular contiene o se sospecha que contiene una proteína diana.

16. El método de la reivindicación 1, en el que dicho pH está en el intervalo de pH 11, 0 a pH 13, 0.

17. El método de la reivindicación 1, en el que dicho reactivo de extracción comprende adicionalmente un desnaturalizante, en el que dicho desnaturalizante es dodecil sulfato sódico (SDS) , urea o sarcosilo.

18. El método de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente la etapa de filtrar el extracto de proteínas a través de un filtro.

19. El método de la reivindicación 18, en el que el filtro tiene un tamaño de poro de entre 0, 1 μm y 50, 0 μm y/o en el

que el filtro está compuesto de polietileno, polipropileno, poli (4-metilbuteno) , poliestireno, polimetacrilato, poli (tereftalato de etileno) , rayón, nylon, poli (butirato de vinilo) , difluoruro de polivinilideno (PVDF) , siliconas, poliformaldehído, celulosa, acetato de celulosa, nitrocelulosa, papel de filtro de fibra de vidrio, cloruro de polivinilo, acetato de polivinilo, copolímeros de acetato de vinilo y cloruro de vinilo, poliamida, policarbonato, orlón, poliéster, poliestireno o cualquier combinación de los mismos.

20. El método de la reivindicación 1, en el que dicha proteína diana se conoce previamente o se caracteriza de otro modo, y el método comprende adicionalmente someter a ensayo la presencia de dicha proteína en dicho extracto de proteínas.

21. El método de la reivindicación 20 en el que dicho ensayo:

usa un agente de captura para dicha proteína diana, o usa una matriz de perlas citométricas (CBA) o ensayo basado en perlas multiplexadas, o incluye un ensayo inmunológico.

22. El método de la reivindicación 21, en el que dicho ensayo:

es un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) ; o es un ensayo inmunocromatográfico o ensayo de flujo lateral (LF) , que opcionalmente usa partículas de oro 45 conjugadas con anticuerpos monoclonales; o usa anticuerpos monoclonales marcados con fluorescencia; o usa partículas quimioluminiscentes, partículas de látex coloreadas/teñidas, partículas para Raman de SERS, núcleos de oro revestidos con sílice con diversos colorantes indicadores, o núcleos de plata revestidos con sílice con colorantes indicadores; o emplea el uso consecutivo de uno o más anticuerpos monoclonales.

23. El método de la reivindicación 4, en el que las células en la muestra celular están fijadas con un fijador químico, seleccionado opcionalmente entre el grupo que consiste en alcoholes, aldehídos, cetonas, tetraóxido de osmio, ácido acético, ácido pícrico, sales de iones metálicos pesados y propilenglicol.

24. El método de la reivindicación 23, en el que el alcohol es metanol o etanol; el aldehído es glutaraldehído o formaldehído; y la cetona es acetona.

25. El método de la reivindicación 15 o de la reivindicación 23, en el que dichas células fijadas están presentes en un medio de transporte que comprende metanol o etanol.

26. El método de la reivindicación 20 o de la reivindicación 23, en el que dichas células fijadas o sin fijar son células del cuello uterino.

27. El método de la reivindicación 20, en el que dichas células fijadas o sin fijar se reciben a partir de una posición lejana antes de dicha etapa de puesta en contacto a) , y, opcionalmente, en donde el método comprende adicionalmente d) comunicar resultados de dicho ensayo a una posición lejana.

28. El método de la reivindicación 4, en el que la proteína viral diana está codificada por un virus patógeno.

29. El método de la reivindicación 28, en el que el virus patógeno se selecciona entre el grupo que consiste en VIH, virus del Ébola, virus de Marburg, virus de la hepatitis, virus sincitial respiratorio (RSV) , virus del herpes simplex (VHS) y virus del papiloma humano (VPH) .

30. El método de las reivindicaciones 4, 15 o 28, en el que la proteína viral diana es la proteína E6 o E7 del VPH. 10

31. El método de la reivindicación 30, en el que el VPH es la cepa del VPH 4, 6, 11, 20, 24, 28, 36, 48, 50, 16, 18, 31, 35, 30, 39, 45, 51, 52, 56, 59, 58, 33, 66, 68, 69, 26, 53, 73 u 82; o en el que el VPH es una cepa de VPH oncogénico seleccionada entre el grupo que consiste en VPH 26, VPH 53, VPH 66, VPH 73, VPH 82, VPH 16, VPH 18, VPH 31, VPH 35, VPH 30, VPH 39, VPH 45, VPH 51, VPH 52, VPH 56,

VPH 59, VPH 58, VPH 33, VPH 68, VPH 69 y VPH 82.

32. El método de la reivindicación 4 que comprende adicionalmente detectar la presencia de la proteína viral diana en el extracto, opcionalmente en el que la detección usa un agente de captura para la proteína viral diana.

33. El método de la reivindicación 32, en el que:

la proteína diana es la proteína E6 del VPH y el agente de captura es un anticuerpo frente a la proteína E6; o la proteína diana es la proteína E6 del VPH y el agente de captura comprende tanto un anticuerpo frente a la proteína E6 como un polipéptido que contiene un dominio PDZ; o 25 la proteína diana es la proteína E6 del VPH; y el agente de captura comprende un péptido BP o AP; o el dominio PDZ es el segundo dominio de MAGI-1, o el dominio PDZ de DLG o TIP1.

34. Un kit para producir un extracto de proteínas, de acuerdo con el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 5, comprendiendo dicho kit:

un reactivo de extracción que tiene un pH mayor de pH 10, 0, y un reactivo de neutralización,

en el que uno o ambos de dicho reactivo de extracción y dicho reactivo de neutralización comprende un alquil éter de 35 polioxietileno.

35. El kit de la reivindicación 34, que comprende adicionalmente reactivos para detectar una proteína diana en dicho extracto de proteínas.

(con tampón 2)

con y sin