Método de extracción de proteínas a partir de células.

Un método para la producción de un extracto de proteínas a partir de células fijadas,

que comprende:

a) poner en contacto dichas células fijadas con un reactivo de extracción para producir una composición intermedia con un pH mayor de pH 10, 0; y

b) poner en contacto dicha composición intermedia con un reactivo de neutralización para producir dicho extracto de proteínas, en donde dicho extracto de proteínas tiene un pH desde pH 6, 5 hasta pH 8, 0,

en el que uno o ambos de dicho reactivo de extracción y dicho reactivo de neutralización comprenden un detergente no iónico.

Método de extracción de proteínas a partir de células Referencia cruzada Esta solicitud reivindica las ventajas de la Solicitud Provisional de EE.UU. U.S. Nº 60/747.076, presentada el 11 de mayo de 2006.

Antecedentes de la invención En muchos métodos diagnósticos se toman células de un sujeto y se depositan en un medio líquido que contiene un fijador. Las células se fijan en el medio y son examinadas citológicamente con objeto de proporcionar un diagnóstico. Por ejemplo, la detección de células precancerosas o cancerosas en tejido cervicouterino se realiza rutinariamente mediante una valoración microscópica de células cervicouterinas exfoliadas. Este método, desarrollado por George N. Papanicolaou y conocido como la prueba de "Pap", implica la exfoliación de células cervicouterinas de una mujer mediante el uso de un dispositivo de muestreo, depositar las células exfoliadas en un medio de transporte que contiene un fijador y depositar después las células en un portaobjetos. Entonces las células se tiñen y son examinadas mediante microscopía óptica, para que un profesional médico experimentado busque anomalías celulares. Cada año se realizan más de 55 millones de pruebas de Pap sólo en los Estados Unidos.

A pesar del éxito de dichas pruebas citológicas, las pruebas tienden a errores. Por ejemplo, se ha estimado que hasta el 40 % de las pruebas convencionales de Pap están comprometidas por la presencia de contaminantes tales como mucus, células sanguíneas y células inflamatorias de ocultamiento. Estos contaminantes producen unos resultados falsos negativos, unos resultados falsos positivos y una cantidad significativa de trabajo de seguimiento. Véase, por ejemplo, Koss, L. G. (1989) , The Papanicolaou Test for Cervical Cancer Detection: A Triumph and a Tragedy, JAMA 261: 737 -743; véase también DeMay, "Problems in Pap Smear Interpretation", Arch. Pathol. Lab. Med. 121: 229 -23 (1997) .

En vista de lo anterior, hay una necesidad de métodos diagnósticos moleculares complementarios para el análisis de células que están presentes en un medio líquido que contiene un fijador. Dichos métodos no son, sin embargo, directos, ya que no siempre es posible realizar dichos métodos sobre células fijadas. Por ejemplo, ciertos fijadores (por ejemplo, los empleados como medio de transporte en sistemas de prueba THINPREP™ o SUREPATH™) pueden provocar que ciertas proteínas celulares precipiten o se agreguen, haciendo así que esas proteína sean insolubles y difíciles o imposibles de detectar de forma fiable mediante el uso de un medio convencional, por ejemplo, mediante el uso de un ensayo de inmunoadsorción ligado a enzima (ELISA) u otra prueba inmunológica.

El documento WO0057906 desvela el desensamblaje de las VLPs del VPH con un tampón que tiene un pH desde 7, 0 hasta 10, preferiblemente un pH de 8, 0 y puede comprender un éter de polioxietilen alquilo (pero preferiblemente comprende Polysorbate 80) , tras lo cual el pH se reduce.

El documento EP0363110 desvela un método de extracción de antígenos del herpes, de clamidia y de gonococos mediante el uso de un elevado pH, a saber, un pH de al menos 10. Después de la extracción se añade un reactivo de neutralización.

Existe por tanto una gran necesidad de métodos y composiciones para la extracción de proteínas a partir de células fijadas de una forma que les permita ser adecuadas para su uso en ensayos moleculares, por ejemplo, de detección inmunológica. La invención descrita en este documento satisface esta necesidad y otras.

Literatura La literatura de interés incluye: las Patentes de EE.UU. 6.890.729, 6.337.189 y la solicitud de patente publicada de EE.UU. 20050032105.

Sumario de la invención Se proporcionan métodos para la producción de un extracto proteico a partir de células fijadas. En términos generales, los métodos implican: aumentar el pH de las células a un pH mayor de pH 10, 0 para producir una composición intermedia, y después, en presencia de un detergente no iónico, neutralizar el pH de la composición intermedia para producir el extracto proteico, en el que dicho extracto proteico tiene un pH desde pH 6, 5 hasta pH 8, 0. El método puede incluir: a) poner en contacto las células con un reactivo de extracción para producir una composición intermedia con un pH mayor de pH 10, 0; y b) poner en contacto la composición intermedia con un reactivo de neutralización para neutralizar el pH de la composición intermedia y producir el extracto proteico, en el que dicho extracto proteico tiene un pH desde pH 6, 5 hasta pH 8, 0. Uno o ambos de los reactivos de extracción, y el reactivo de neutralización, contienen el detergente no iónico. En ciertas formas de realización, las células fijadas pueden ser células cervicouterinas exfoliadas fijadas.

Definiciones Salvo que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado al comprendido habitualmente por el experto habitual en la técnica a la que pertenece la invención. Además, ciertos elementos se definen a continuación en aras de claridad y facilidad de referencia.

El término "muestra celular", según se usa en el presente documento, se refiere a una composición líquida que contiene una o más células de interés. Una muestra celular puede ser una muestra química que contiene células extraídas de (por ejemplo, diseccionadas o exfoliadas de) un individuo, incluyendo pero no se limitan a, por ejemplo, células del plasma, del suero, del líquido cefalorraquídeo, del semen, del fluido linfático, de secciones externas de la piel, de los tractos respiratorio, intestinal y genitourinario, lágrimas, saliva, leche, células sanguíneas, tumores u órganos. En otras formas de realización, la muestra celular puede contener células crecidas in vitro (incluyendo, pero no se limitan a, células de un medio de cultivo celular, células infectadas por virus, células recombinantes, etc.) . En ciertas formas de realización, la muestra celular puede contener células con el mayor riesgo de ser infectadas por el VPH. En estas formas de realización, las células pueden obtenerse a partir de un cuello uterino, de una vulva, de una vagina, de un ano, de un pene, de una boca o de una garganta. En ciertas formas de realización, las células son de membrana mucosa y pueden tener un origen epitelial. Una muestra celular puede contener o no contaminantes distintos a las células exfoliadas o diseccionadas. Por ejemplo, en una muestra celular puede haber presente mucus o células bacterianas, de levadura o sanguíneas.

"VPH" es el virus del papiloma humano, incluyendo, pero no se limita a, las cepas del VPH 4, 11, 20, 24, 28, 36, 48, 50, 16, 18, 31, 35, 30, 39, 45, 51, 52, 56, 59, 58, 33, 66, 68, 69, 26, 53, 73 y 82.

Una "cepa oncogénica del VPH" es una cepa del VPH conocida por provocar cáncer cervicouterino, según determina el National Cancer Institute (NCI, 2001) .

Una "proteína oncogénica E6" es una proteína E6 codificada por una cepa oncogénica del VPH. Algunos ejemplos de cepas oncogénicas son: VPH 26, VPH 53, VPH 66, VPH 73, VPH 82, VPH 16, VPH 18, VPH 31, VPH 35, VPH 30, VPH 39, VPH 45, VPH 51, VPH 52, VPH 56, VPH 59, VPH 58, VPH 33, VPH 66, VPH 68, VPH 69 y VPH 82. Las secuencias de aminoácidos de las proteínas oncogénicas E6 están depositadas en la base de datos del GenBank del NCBI. Sin desear ceñirnos a ninguna teoría, generalmente se cree que las cepas del VPH 4, 11, 20, 24, 28, 36, 48 y 50 no son oncogénicas.

Los términos "polipéptido" y "proteína" se usan de forma intercambiable. El término "polipéptido" incluye polipéptidos en los que el esqueleto convencional se ha reemplazado por un esqueleto no natural o sintético, y péptidos en los que uno o más de los aminoácidos convencionales se han reemplazado por uno o más aminoácidos no naturales o sintéticos.

El término "proteína de fusión" o los equivalentes gramaticales del mismo, hacen referencia a una proteína formada por una pluralidad de componentes polipéptidicos, que mientras que no están unidos en su estado natural, están unidos por sus respectivos terminales amino y carboxilo a través de un enlace peptídico para formar un único polipéptido continuo. Las proteínas de fusión pueden ser una combinación de dos, tres o incluso cuatro o más proteínas diferentes. El término polipéptido incluye proteínas de fusión, incluyendo, pero no se limitan a, proteínas de fusión con una secuencia de aminoácidos heteróloga, fusiones con secuencias líder heterólogas y homólogas, con o sin residuos N-terminales de metionina; proteínas marcadas inmunológicamente; proteínas de fusión con compañeros de fusión detectables, por ejemplo, proteínas... [Seguir leyendo]

1. Un método para la producción de un extracto de proteínas a partir de células fijadas, que comprende:

a) poner en contacto dichas células fijadas con un reactivo de extracción para producir una composición intermedia con un pH mayor de pH 10, 0; y b) poner en contacto dicha composición intermedia con un reactivo de neutralización para producir dicho extracto de proteínas, en donde dicho extracto de proteínas tiene un pH desde pH 6, 5 hasta pH 8, 0,

en el que uno o ambos de dicho reactivo de extracción y dicho reactivo de neutralización comprenden un detergente no iónico.

2. El método de la reivindicación 1, en el que dicho método comprende:

a) poner en contacto dichas células fijadas con un reactivo de extracción para producir una composición intermedia con un pH mayor de pH 10, 0; y b) poner en contacto dicha composición intermedia con un reactivo de neutralización que comprende un detergente no iónico;

para producir dicho extracto de proteínas.

3. El método de la reivindicación 1, en donde dicho método comprende:

a) poner en contacto dichas células fijadas con un reactivo de extracción que comprende un detergente no iónico para producir una composición intermedia con un pH mayor de pH 10, 0; y, b) poner en contacto dicha composición intermedia con un reactivo de neutralización;

para producir dicho extracto de proteínas.

4. El método de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente recibir una muestra celular que comprende dichas células fijadas antes de la etapa a) .

5. El método de la reivindicación 4, en el que dicha muestra celular se recibe desde una ubicación remota.

6. El método de la reivindicación 1, en el que:

a) dichas células fijadas son células cervicouterinas fijadas; o b) dichas células fijadas están presentes en un medio de transporte que comprende metanol o etanol; o c) dicho pH de la composición intermedia está en el intervalo de pH 11, 0 a pH 13; o d) dicho detergente no iónico comprende un detergente TRITON™ o TWEEN™.

7. El método de la reivindicación 1, en el que dicho reactivo de extracción contiene un desnaturalizante.

8. El método de la reivindicación 7, en el que dicho desnaturalizante se elige de entre dodecil sulfato sódico (SDS) , urea o sarcosilo.

9. El método de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente la comprobación de la presencia de dicha proteína en dicho extracto de proteínas.

10. El método de la reivindicación 9, en el que:

a) dicha comprobación emplea un agente de captura para dicha proteína; o b) dicha comprobación incluye un ensayo inmunológico; o c) dicho ensayo es un ensayo de inmunoadsorción ligados a enzima (ELISA) ; o d) dicha proteína es una proteína del virus del papiloma humano (VPH) ; o e) dicha proteína es una proteína E6 del VPH; o f) dichas células fijadas son células cervicouterinas exfoliadas; o g) dichas células fijadas son recibidas desde una ubicación remota antes de dicha etapa de contacto a) .

11. El método de la reivindicación 9, que comprende adicionalmente la comunicación de los resultados de dicha prueba a una ubicación remota.

12. Un kit para la producción del extracto de proteínas a partir de células fijadas, comprendiendo dicho kit:

a) un reactivo de extracción que tiene un pH mayor de pH 10, 0, y b) un reactivo de neutralización que tiene un pH entre pH 4, 0 y pH 8, 0;

en el que dicho reactivo de extracción, o tanto dicho reactivo de extracción como dicho reactivo de neutralización, comprenden un detergente no iónico.

13. El kit de la reivindicación 12 que comprende adicionalmente instrucciones para su uso. 5

14. El kit de la reivindicación 12, que comprende adicionalmente reactivos para la detección de una proteína en dicho extracto de proteínas.

15. El kit de la reivindicación 14, en el que:

a) dichos reactivos incluyen un agente de captura para dicha proteína; o b) dicha proteína es una proteína E6 del VPH.