Incremento de la expresión de una secuencia de nucleótidos heteróloga monocatenaria de vectores virales recombinantes diseñando la secuencia de modo que forma pares de bases intracatenarios.

Una preparación vírica de virus adenoasociado recombinante (VAAr),

preparación vírica de VAAr que está esencialmente libre de virus auxiliar, que comprende un vector de VAAr, donde el vector de VAAr comprende una secuencia de nucleótidos heteróloga que comprende una región codificante que forma pares de bases intracatenarios, donde la formación de pares de bases intracatenarios es suficiente para permitir la transcripción sin previa replicación de ADN de la cadena, donde la expresión de la región codificante de la secuencia heteróloga está incrementada con relación a un vector de VAAr que carece de formación de pares de bases intracatenarios suficiente para incrementar dicha expresión, y donde el vector VAAr comprende una o más secuencias de repetición terminal invertida (ITR) que flanquean dicha secuencia heteróloga, para su uso en un método de tratamiento del organismo humano o animal mediante terapia.

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DESCRIPCIÓN

Incremento de la expresión de una secuencia de nucleótidos heteróloga monocatenaria de vectores virales recombinantes diseñando la secuencia de modo que forma pares de bases intracatenarios 5

Campo técnico

La invención está dentro del campo de las construcciones víricas para la administración de genes, en particular de vectores víricos recombinantes, tales como los vectores de virus adenoasociado (VAA) , para utilización en terapia génica y en el cribado de productos genómicos.

Antecedentes

Los vectores recombinantes basados en parvovirus, tales como el virus adenoasociado (VAA) , muestran ser prometedores para la terapia génica. Sin embargo, la obtención de niveles suficientes, eficaces, de expresión de un transgén en diferentes tipos celulares ha presentado problemas. Algunos tipos celulares no son permisivos, en el sentido de que el inicio de la transcripción o de la traducción del transgén es ineficaz, con una expresión, por consiguiente, muy lenta para iniciarse, si es que se inicia. Todavía en muchos contextos es deseable conseguir una expresión suficientemente rápida.

Los parvovirus son virus de ADN monocatenario pequeños, encapsidados, cuyo genoma de ADN está flanqueado por secuencias repetidas terminales invertidas (ITR) . El genoma de ADN de los parvovirus codifica proteínas requeridas para la replicación (Rep) y la encapsidación (Cap) . El virus adenoasociado (VAA) es un parvovirus defectuoso que se replica únicamente en células en las que se proporcionan ciertas funciones denominadas "funciones cooperadoras". Normalmente estas funciones son proporcionadas por la infección de un virus auxiliar. Pueden encontrarse revisiones generales de parvovirus, incluyendo VAA, en, por ejemplo, Carter (1989) Handbook of Parvoviruses; Berns (1995) Virology, Vol. 2, Raven Press, New York, páginas 2173-2197; Carter y col. (1983) En "The Parvoviruses" (K.I. Berns, ed.) Plenum Press, New York; Berns.

El genoma del VAA nativo es una molécula de ADN monocatenario lineal de 4.675 nucleótidos aproximadamente. Srivastava y col. (1983) J. Virol. 45:555-564. El genoma del VAA nativo contiene secuencias que codifican las proteínas Rep y Cap (los genes rep y cap, respectivamente) flanqueadas por una secuencia repetida terminal invertida (ITR) de 145 nucleótidos. Hermonat y col. (1984) J. Virol. 51:329-339; y Tratschin y col. (1984) J. Virol 51:611-619. El ciclo vital del VAA se presenta a continuación. El ciclo vital de otros parvovirus es similar, con la excepción de que los demás parvovirus no requieren funciones cooperadoras para su replicación (excepto hasta el punto de que puedan requerir que la célula hospedadora entre en fase S) .

Ciclo vital del VAA

Esquemáticamente, un ciclo infeccioso productivo del VAA en una célula que ha sido infectada con un segundo virus auxiliar (o en una célula en la que están presentes funciones cooperadoras) procede según sigue (ver la Figura 1) . La adsorción del VAA a una célula hospedadora es seguida por la inserción del genoma vírico monocatenario en un proceso conocido generalmente en la técnica como "transducción". En presencia de ciertas funciones de la célula hospedadora relacionadas con la replicación (tales como ADN polimerasas) , el genoma vírico monocatenario 45 entrante es convertido es una forma replicativa bicatenaria. Ver la Figura 2. Se cree que el inicio de esta conversión de monocatenario en bicatenario (SSâDS) implica la formación de una estructura en horquilla por secuencias dentro de la ITR del VAA, que genera una estructura molde-cebador a partir de la cual puede proceder el inicio de la replicación del ADN. El producto de esta conversión SSâDS, la forma replicativa (RF) , es una molécula bicatenaria autocomplementaria que está cerrada covalentemente en un extremo (el extremo en el cual se inició la replicación) . Ver la Figura 3. La RF es por tanto una molécula bicatenaria que tiene la misma complejidad de secuencia, pero dos veces aproximadamente el peso molecular, que el genoma del VAA entrante (esto es, para un genoma nativo de 4, 7 kilobases aproximadamente, la RF tendrá un peso molecular correspondiente a 4, 7 kilopares de bases) . Aunque se cree que la formación de una horquilla terminal para cebar la replicación tiene lugar rápidamente, se postula que la extensión de esta horquilla para formar la RF bicatenaria es una de las etapas limitantes de la velocidad en la 55 replicación del VAA. Este proceso de generación de la RF puede tener lugar en ausencia de una función cooperadora, pero se cree que es potenciado por la función cooperadora. Ver, Carter, B. y col. (1990) vol. I, pp. 169226 y 255-282. Las células que son capaces de producir una progenie de VAA son generalmente consideradas por los expertos en la técnica como células "permisivas", y este proceso de conversión en un molde bicatenario es también conocido como "activación metabólica".

Después de su formación, la RF se replica para generar una progenie de RFs en un proceso facilitado por los productos del gen rep del VAA y por ciertas funciones cooperadoras (ver más adelante) . Además, la RF sirve como molde para la formación de los genomas de la progenie del VAA, los cuales son empaquetados en partículas víricas. Estos genomas son moléculas de ADN monocatenario de 4, 7 kb aproximadamente y representan las dos 65 polaridades según se encuentran en la molécula de la RF bicatenaria.

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Además de ser necesaria para la síntesis de los genomas de la progenie del VAA, la formación de la RF es requerida para que tenga lugar la transcripción de las proteínas víricas (o en el caso de VAA recombinante, para que tenga lugar la transcripción de secuencias heterólogas tales como un transgén) , ya que los sistemas de polimerización de ARN celular requieren un molde bicatenario. La transcripción de los genes rep y cap del VAA tiene como resultado la producción de las proteínas Rep y Cap. Las proteínas Rep del virus facilitan la amplificación de la RF, la generación de los genomas víricos de la progenie, y pueden desempeñar también una función en la regulación de la transcripción del virus. Las proteínas Cap víricas son proteínas estructurales de la cápsida del virus. Los genomas víricos monocatenarios de la progenie de ambas polaridades están encapsidados en las partículas víricas hijas, que son posteriormente liberadas de la célula hospedadora.

Las funciones cooperadoras implicadas en la replicación de la RF, según describió anteriormente, pueden ser proporcionadas por la coinfección de células infectadas con VAA con adenovirus, virus herpes o poxvirus. Carter (1990) supra. Alternativamente, las células pueden contener genes integrados, víricos o de otro origen, que proporcionen la función cooperadora. Además, el requisito de la función cooperadora puede ser algunas veces obviado por el tratamiento de las células infectadas con VAA con agentes químicos y/o físicos tales como hidroxiurea, irradiación ultravioleta, irradiación X o irradiación gamma, por ejemplo, que pueden inducir reparación celular, sistemas de recombinación y/o replicación, o que pueden afectar de otro modo al metabolismo del ADN celular. Yakobson y col. (1987) J. Virol. 61:972-987; Yakobson y col. (1988) J. Virol. 63:1023-1030; Bantel-Schaal, U. y col. (1988) Virology 164:64-74; Bantel-Schaal, U. y col. (1988) Virology 166:113-122; y Yalkinoglu y col. (1988) Cancer Res. 48:3123-3125. Aunque pueda tener lugar la replicación de la RF, hasta cierto punto, en ausencia de la función cooperadora, en general este proceso es lento y/o ineficaz en ausencia de la función cooperadora.

De la Maza y Carter (1980) J. Biol. Chem. 255:3194-3203 describen moléculas de ADN del VAA variantes obtenidas de partículas del VAA. Algunas de estas moléculas son menores que la longitud unidad y presentan propiedades que sugieren que poseen regiones de autocomplementariedad. Hauswirth y Berns (1979) Virology 93:57-68 describen moléculas variantes similares obtenidas a partir de células infectadas con VAA. Ver la Figura 4. Estas moléculas no contenían secuencias heterólogas; por consiguiente, su capacidad para expresar una secuencia heteróloga no pudo ser evaluada.

Vectores y virus VAA recombinantes

El genoma nativo del VAA ha sido utilizado como base de sistemas de vectores para la administración y la expresión de genes heterólogos en células hospedadoras tales como células de mamífero, tal como para terapia génica. Muzyczka (1992) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158:97-129; Carter, B.J. (1992) Curr. Op. Biotechnol. 3:535-539 y Flotte y col. (1995) Gene Therapy 2:357-362. Los vectores de VAA recombinante (VAAr) , basados en el genoma nativo del VAA, son... [Seguir leyendo]

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1. Una preparación vírica de virus adenoasociado recombinante (VAAr) , preparación vírica de VAAr que está esencialmente libre de virus auxiliar, que comprende un vector de VAAr, donde el vector de VAAr comprende una 5 secuencia de nucleótidos heteróloga que comprende una región codificante que forma pares de bases intracatenarios, donde la formación de pares de bases intracatenarios es suficiente para permitir la transcripción sin previa replicación de ADN de la cadena, donde la expresión de la región codificante de la secuencia heteróloga está incrementada con relación a un vector de VAAr que carece de formación de pares de bases intracatenarios suficiente para incrementar dicha expresión, y donde el vector VAAr comprende una o más secuencias de repetición terminal invertida (ITR) que flanquean dicha secuencia heteróloga, para su uso en un método de tratamiento del organismo humano o animal mediante terapia.

2. Una preparación vírica de VAAr para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde el vector de VAAr comprende además una ITR flanqueada en ambos lados por secuencias heterólogas. 15

3. Una preparación vírica de VAAr para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, donde la secuencia heteróloga codifica una proteína o un ARN de interés terapéutico.

4. Una preparación vírica de VAAr para su uso de acuerdo con la reivindicación 3, donde la secuencia heteróloga 20 codifica un ARN antisentido o una ribozima.

5. Una preparación vírica de VAAr para su uso de acuerdo con la reivindicación 3, donde la secuencia heteróloga es:

(i) un polinucleótido que codifica una proteína útil en terapia génica para aliviar deficiencias causadas por niveles 25 ausentes, defectuosos o subóptimos de una proteína estructural o de un enzima;

(ii) un polinucleótido que se transcribe para dar lugar a una molécula antisentido;

(iii) un polinucleótido que se transcribe para dar lugar a un señuelo que se une a un factor de transcripción o de traducción;

(iv) un polinucleótido que codifica un modulador celular; 30 (v) un polinucleótido que puede hacer que una célula receptora sea susceptible a un fármaco específico;

(vi) un polinucleótido para terapia del cáncer; o (vii) un polinucleótido que codifica un antígeno o un anticuerpo.

6. Una preparación vírica de VAAr para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, donde la secuencia heteróloga es 35 el gen de la timidina quinasa del virus herpes, un gen supresor de tumores E1A o un gen supresor de tumores p53.

7. Una preparación vírica de VAAr para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además un excipiente farmacéuticamente aceptable.

8. Un método para construir una biblioteca que comprende:

(a) poner en contacto una población de células hospedadoras con vectores de VAAr como se define en la reivindicación 1 en condiciones que permitan la introducción de dichos vectores de VAAr en las células; y

(b) seleccionar células que contienen un vector de VAAr. 45

9. Un método para identificar un fenotipo asociado con la expresión de una región codificante de un vector de VAAr como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende:

(a) poner en contacto una célula hospedadora con un vector de VAAr como se define en una cualquiera de las 50 reivindicaciones 1 a 7 en condiciones que permitan la captación del vector;

(b) ensayar la célula con respecto a la expresión de la región codificante de la secuencia heteróloga; y

(c) comparar un fenotipo de la célula que expresa la región codificante de la secuencia heteróloga con un fenotipo de una célula que carece del vector,

donde una diferencia fenotípica indica que el fenotipo de la célula que expresa la secuencia heteróloga es un fenotipo asociado con la expresión de la región codificante.