Identificación y clasificación de partículas víricas en micrografías electrónicas texturizada.

Un procedimiento de identificación y caracterización de partículas víricas en imágenes de micrografía electrónica,

que comprende:

seleccionar una o más estructuras elípticas en una primera imagen (110),

transformar cada estructura seleccionada para deformar cada estructura de la forma elíptica a una forma circular mediante una transformación;

usar las estructuras transformadas con forma circular para formar una plantilla y deformar dicha plantilla mediante una transformación correspondiente a dicha transformación para obtener una pluralidad de plantillas deformadas con forma elíptica; identificar una partícula vírica nueva en una segunda imagen, teniendo la partícula vírica nueva una estructura con forma elíptica usando la pluralidad de plantillas deformadas con forma elíptica, y

determinar qué plantilla es una plantilla preferente que corresponde mejor a la estructura con forma elíptica de la partícula de virus nueva;

en el que dicha transformación de cada estructura seleccionada para deformar la estructura desde la forma elíptica a una forma circular es una transformación lineal, usándose un operador de transformación tetradimensional que implica variables que definen la rotación antes de la transformación (fi d), que alinea las diferentes estructuras elípticas, la deformación radial principal (r), la tasa de deformación (d) dando lugar a la forma elíptica de la partícula vírica, obteniéndose estas tres variables mediante deformación de la forma elíptica para hacerla más circular, y

la rotación después de la deformación (fi_r), que alinea características de las estructuras circulares, tales como la arquitectura poligonal de la pared de la cápside y la posición del núcleo de ADN.

Identificación y clasificación de partículas víricas en micrografías electrónicas texturizadas

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la identificación de estructuras en imágenes. En particular, la presente invención proporciona un procedimiento y una disposición de identificación y clasificación de partículas víricas en micrografías electrónicas texturizadas.

Antecedentes de la invención

El ensamblaje de virus es un proceso intrincado y objeto de una investigación intensa. Los virus usan una célula huésped para producir su progenie de partículas víricas llevando a cabo un proceso complejo de maduración y transporte intracelular. Puede realizarse un seguimiento de este proceso con alta magnificación usando microscopia electrónica, que permite la identificación visual de diferentes tipos de partículas víricas en compartimentos celulares diferentes. Asuntos importantes que permanecen sin resolver incluyen la identidad de las proteínas víricas que están implicadas en cada etapa de este proceso de ensamblaje de virus, así como el mecanismo de la translocación intracelular subyacente y la localización de diferentes tipos de partículas víricas durante la maduración del virus. Los aspectos estructurales de la maduración del virus son generalmente complicados de abordar, aunque técnicas de visualización tales como tomografía y criomicroscopia electrónica (crio-ME) han contribuido enormemente a la vasta información de estructuras víricas. Estas técnicas proporcionan información sobre partículas víricas estables, a menudo maduras. Hay disponibles herramientas genéticas para producir mutantes de componentes proteicos víricos claves y pueden visualizarse los efectos estructurales mediante ME. No obstante, hay una carencia de herramientas apropiadas para caracterizar los efectos estructurales, especialmente formas de partícula intermedias y oscuras, y para cuantificarlos apropiadamente de un modo objetivo. Las herramientas de análisis por imagen para caracterizar y cuantificar partículas víricas, la maduración y el transporte intracelular facilitarían estudios objetivos de estados de ensamblaje de virus diferentes usando microscopia electrónica. Se adquiere mucha información, pero se necesita estructurarla y estadísticas producidas a partir de la misma para evaluar el efecto y extraer conclusiones

Sumario de la presente invención

La caracterización de la morfología estructural de partículas víricas en micrografías electrónicas es una labor complicada, pero deseable en relación con la investigación del proceso de maduración y la detección de cambios en la morfología de partículas víricas en respuesta al efecto de una mutación o de fármacos antivíricos que se estén administrando. Por lo tanto, se ha desarrollado un procedimiento para describir y clasificar formas de partículas víricas en micrografías electrónicas en base a la determinación de las características invariables de la proyección de una estructura vírica dada. La plantilla para la partícula vírica se crea en base a la información obtenida a partir de un conjunto de estudio pequeño de micrografías electrónicas y después se usa para clasificar y cuantificar estructuras similares de interés en un número ilimitado de micrografías electrónicas mediante un procedimiento de correlación. Usando análisis de deformación lineales, este algoritmo novedoso descrito en el presente documento puede manipular variaciones de partículas víricas tales como elipticidad y, por lo tanto, permite la evaluación de propiedades tales como el tamaño y la orientación de una partícula vírica. La aplicación práctica del procedimiento se demuestra mediante la capacidad para localizar tres clases diferentes de partículas víricas en micrografías electrónicas de transmisión de fibroblastos infectados con citomegalovirus humano.

En resumen, el procedimiento es para la identificación y caracterización de estructuras en micrografías electrónicas. Se seleccionan estructuras en una primera imagen. Las estructuras tienen un primer tipo de forma deformado en una primera dirección. Las estructuras seleccionadas se transforman en un segundo tipo de forma diferente a partir del primer tipo de forma. Las estructuras transformadas del segundo tipo de forma se usan para formar una pluralidad de plantillas. Se identifica una nueva estructura en una segunda imagen. La nueva estructura tiene el primer tipo de forma. La estructura de segundo tipo de forma de cada plantilla se deforma en la primera dirección. Se determina qué plantilla es una plantilla preferente que mejor corresponde a la nueva estructura.

Breve descripción de los dibujos

Las Fig.lA y 1B muestran imágenes de micrografía electrónica de transmisión típicas del desarrollo de herpesvirus;

La Fig 2A muestra nucleocápsides de herpesvirus vacíos;

La Fig. 2B muestra nucleocápsides del herpesvirus con un núcleo translúcido;

La Fig. 2C muestra nucleocápsides de herpesvirus que contienen AND empaquetado;

La Fig. 3A muestra una particular vírica con una forma elíptica;

La Fig. 3B muestra una partícula vírica que se ha deformado para hacerla circular.

La Fig. 4A-C muestra funciones de ensayo para estructuras de cápside víricas (A, B y C) en micrografías electrónicas que no usan reducción de coeficiente (ninguna) o con el 8 % de los coeficientes mostrando menos variación (VAR);

La Fig. 5A muestra una correspondencia de una función de ensayo A con una estructura de cápside auténtica y con una estructura similar pero falsa.

La Fig. 5B muestra una correspondencia de una función de ensayo B con una estructura de cápside auténtica y con una estructura similar pero falsa.

La Fig. 6 muestra correspondencia con la función de ensayo A dentro de una vesícula.

La Fig. 7A-C muestra relaciones positivas falsas (FPR) y negativas falsas (FNR) para las diferentes funciones de ensayo A, B y C, respectivamente.

La Fig. 8 muestra las funciones de probabilidad positivas (PPF) para las funciones de ensayo A, B y C.

La Fig. 9 muestra una comparación del número total real de estructuras víricas presentes en un conjunto de imágenes de ensayo (eje X) determinadas por el virólogo con un número identificado mediante nuestro procedimiento (eje Y); y

La Fig.1 muestra una producción automatizada de un mapa que identifica localizaciones de interés en una micrografía electrónica ilustrada a este respecto para la función de ensayo C.

Descripción detallada

El desarrollo de un sistema automatizado para ayudar en la identificación de partículas víricas en micrografías electrónicas se describe en el presente documento. Como modelo se han usado fibroblastos que están infectados con citomegalovirus humanos (HCMV), un virus de la clase de p- herpes. Debe entenderse que el herpesvirus se usa solo como ejemplo ilustrativo y la invención no está limitada al herpesvirus. Durante la infección con citomegalovirus humanos, se producen muchas formas intermedias diferentes de la partícula vírica. Durante el ensamblaje de los herpesvirus, la célula huésped se fuerza a hacer copias del material genético vírico y a producir cápsides, una cubierta de proteínas víricas que envuelve y protege el material genético. Las cápsides son estructuras esféricas que pueden variar con respecto al tamaño y a la simetría y pueden, cuando están maduras, estar envueltas por una membrana de dos capas. La maduración de las cápsides víricas es un estadio importante en la producción de partículas víricas y uno que se estudia frecuentemente. No obstante, su apariencia en micrografías electrónicas varía considerablemente, lo que hace que el análisis sea un reto. Una característica única del herpesvirus es el tegumento, una capa de proteínas víricas que rodea la cápside antes de la envoltura final. La envoltura se adquiere mediante la aparición de cápsides con tegumento en vesículas secretoras en el citoplasma. Después de ello, las partículas víricas infecciosas salen de la célula huésped por fusión de estos virus que contienen vesículas con la membrana plasmática.

Se ha desarrollado un procedimiento objetivo para la clasificación y cuantificación de partículas víricas en dichas micrografías electrónicas de transmisión. En el análisis relacionado de imágenes microscópicas crio-electrónicas (crio-ME), se han realizado considerablemente más esfuerzos de exploración de diferentes procedimientos de identificación. En crio-micrografías, la correlación cruzada usando múltiples plantillas y los procedimientos para la detección de bordes se han aplicado con éxito.

Enfoques adecuados que permiten la caracterización... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de identificación y caracterización de partículas víricas en imágenes de micrografía electrónica, que comprende:

seleccionar una o más estructuras elípticas en una primera imagen (11),

transformar cada estructura seleccionada para deformar cada estructura de la forma elíptica a una forma circular mediante una transformación;

usar las estructuras transformadas con forma circular para formar una plantilla y deformar dicha plantilla mediante una transformación correspondiente a dicha transformación para obtener una pluralidad de plantillas deformadas con forma elíptica; identificar una partícula vírica nueva en una segunda imagen, teniendo la partícula vírica nueva una estructura con forma elíptica usando la pluralidad de plantillas deformadas con forma elíptica, y

determinar qué plantilla es una plantilla preferente que corresponde mejor a la estructura con forma elíptica de la partícula de virus nueva;

en el que dicha transformación de cada estructura seleccionada para deformar la estructura desde la forma elíptica a una forma circular es una transformación lineal, usándose un operador de transformación tetradimensional que implica variables que definen la rotación antes de la transformación (fi d), que alinea las diferentes estructuras elípticas, la deformación radial principal (r), la tasa de deformación (d) dando lugar a la forma elíptica de la partícula vírica, obteniéndose estas tres variables mediante deformación de la forma elíptica para hacerla más circular, y

la rotación después de la deformación (fi_r), que alinea características de las estructuras circulares, tales como la arquitectura poligonal de la pared de la cápside y la posición del núcleo de ADN.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, procedimiento que además comprende analizar otras plantilla para verificar que la plantilla preferente proporciona la mejor correspondencia.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, procedimiento que además comprende seleccionar estructuras basadas en parámetros relacionados con el tamaño y la forma elíptica y la elipticidad de las estructuras.

4. El procedimiento según la reivindicación 1, procedimiento que además comprende analizar otras direcciones diferentes a la primera dirección para verificar que la primera dirección de deformación de la plantilla óptima proporciona la mejor correspondencia de la nueva forma elíptica.

5. El procedimiento según la reivindicación 4, procedimiento que además comprende determinar que la correspondencia es menos exacta en direcciones diferentes a la primera dirección.

6. El procedimiento según la reivindicación 1, procedimiento que además comprende determinar un estadio de madurez y un tipo de estructura de la nueva forma elíptica en base a la plantilla preferente.

7. El procedimiento según la reivindicación 1, procedimiento que además comprende filtrar estructuras que están dispuestas dentro de una distancia radial de la nueva forma elíptica.