Vectores de flavivirus quiméricos.

Vector de flavivirus, que comprende una proteína de cubierta que comprende un péptido extraño insertado en laproteína de cubierta,

en el que dicho péptido extraño tiene una longitud de 20-55 aminoácidos, en el que dichovector es un flavivirus quimérico que comprende las proteínas de la cápsida y no estructurales de un virus de fiebreamarilla 17D y las proteínas de premembrana y de cubierta de un virus de encefalitis japonesa SA14-14-2, y elpéptido extraño está insertado en una posición de aminoácidos seleccionada de entre 59, 231, 287, 340 o 436 de laproteína de cubierta del virus de la encefalitis japonesa SA14-14-2

Vectores de flavivirus quiméricos.

Campo de la invención La presente invención se refiere a vectores de flavivirus quiméricos.

Antecedentes de la invención Los flavivirus son virus de ARN de hebra positiva pequeños con cubierta. Las proteínas de flavivirus son producidas por traducción de un único marco de lectura abierto largo para generar una poliproteína, lo que es seguido por una serie compleja de escisiones proteolíticas post-traduccionales de la poliproteína mediante una combinación de proteasas del hospedante y víricas para generar proteínas víricas maduras (Amberg et al., J. Virol. 73:8083-8094, 1999; Rice, “Flaviviridae”, en Virology, Fields (ed.) , Raven-Lippincott, Nueva York, 1995, Volumen I, p. 937) . Las proteínas estructurales víricas están dispuestas en la poliproteína en el orden C-prM-E, en el que “C” es la cápsida, “prM” es un precursor de la proteína M unida a la cubierta vírica, y “E” es la proteína de cubierta. Estas proteínas están presentes en la región N-terminal de la poliproteína, mientras que las proteínas no estructurales (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, y NS5) están situadas en la región C-terminal de la poliproteína.

Se ha obtenido un flavivirus quimérico que incluye las proteínas C y no estructurales de la cepa (YF 17D) de la vacuna del virus de la fiebre amarilla y las proteínas prM y E de una cepa del virus de encefalitis japonesa atenuado (SA 14-14-2) . Se ha demostrado que esta quimera, denominada ChimeriVax™-JE, induce la producción de anticuerpos neutralizantes contra JE en monos rhesus inmunizados, así como protege a estos monos de la encefalitis clínica tras la exposición a JE, en comparación con controles no inmunizados. Se demostró que ChimeriVax™-JE cumple los requisitos de seguridad preclínicos para una vacuna humana (Monath et al., J. Virol. 74 (4) :1742-1751, 2000) .

Se obtuvo una quimera similar que incluye las proteínas C y no estructurales de YF 17D y las proteínas prM y E de la cepa del Dengue-2. Se demostró que esta quimera, denominada ChimeriVax-D2, induce anticuerpos neutralizantes contra el virus del Dengue-2 en monos rhesus, así como protege a estos monos de la viremia tras la exposición al Dengue-2, en comparación con controles no inmunizados. También se demostró que ChimeriVax-D2 es segura y genéticamente estable (Guirakhoo et al., J. Virol. 74 (12) :5477-5485, 2000) .

Sumario de la invención Se describen métodos para identificar sitios en las proteínas de cubierta de flavivirus quiméricos o flavivirus genéticamente atenuados que son permisivos para la inserción de péptidos extraños. Estos métodos incluyen las etapas de: (i) introducir una molécula de ácido nucleico que codifica un péptido extraño en un gen que codifica una proteína de cubierta de flavivirus; (ii) generar un vector de flavivirus que incluye una proteína de cubierta codificada por el gen, en el que la proteína de cubierta contiene el péptido extraño; y (iii) determinar si el vector de flavivirus generado en la etapa (ii) es permisivo para la inserción.

La invención proporciona un vector de flavivirus según la reivindicación 1.

Los péptidos extraños insertados en los vectores de la invención pueden incluir epítopos derivados de, por ejemplo, antígenos de patógenos víricos, bacterianos o parasitarios, o pueden incluir epítopos derivados de antígenos asociados a tumores. Más abajo se proporcionan ejemplos de estos y otros péptidos.

Las moléculas de ácido nucleico se introducen en el gen de cubierta del flavivirus del virus de la encefalitis japonesa SA14-14-2.

Los métodos descritos pueden incluir además comparar el análisis de los vectores de flavivirus con un análisis similar del flavivirus a partir del que se derivó.

Los péptidos extraños insertados en los vectores pueden incluir epítopos derivados de antígenos de patógenos víricos, bacterianos o parasitarios. Como alternativa, los péptidos extraños pueden incluir epítopos derivados de antígenos asociados a tumores.

También se incluyen en la invención composiciones farmacéuticas que incluyen los vectores de flavivirus descritos anteriormente y vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables, así como métodos para suministrar péptidos a pacientes administrando a los pacientes tales composiciones. Estos métodos se pueden llevar a cabo, por ejemplo, cuando los péptidos son antígenos, para inducir una respuesta inmunitaria frente a patógenos o tumores a partir de los que derivan los antígenos. La invención también incluye el uso de estas composiciones para el suministro de péptidos, así como su uso en la preparación de medicamentos para el suministro de péptidos.

La invención también incluye moléculas de ácidos nucleicos que incluyen los genomas de los flavivirus descritos anteriormente o de sus complementos.

La invención proporciona varias ventajas. Por ejemplo, los vectores de flavivirus quiméricos que se pueden usar en la invención están suficientemente atenuados para ser seguros, y todavía son capaces de inducir inmunidad protectora a los flavivirus a partir de los que derivan las proteínas de cubierta en las quimeras y, en particular, los epítopos insertados en las quimeras. La seguridad adicional procede del hecho de que los vectores usados en la invención son quiméricos, eliminando así la posibilidad de inversión a tipo salvaje. Una ventaja adicional de los vectores usados en la invención es que los flavivirus se replican en el citoplasma de las células, de manera que la estrategia de replicación del virus no implica la integración del genoma vírico en la célula hospedante, proporcionando una medida de seguridad importante. Además, como se discute adicionalmente más abajo, se puede usar un único vector de la invención para suministrar múltiples epítopos a partir de un único antígeno, o epítopos derivados de más de un antígeno.

Otras características y ventajas de la invención serán manifiestas a partir de la siguiente descripción detallada, los dibujos, y las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos La figura 1 es una representación esquemática de un método de mutagénesis de transposones, llevado a cabo con el gen que codifica la cubierta de JE.

La figura 2 muestra los resultados del análisis mediante PCR de mutantes de inserción Tn5 del gen que codifica la cubierta de JE. Los clones estables que poseen un transposón en la cubierta de JE se muestran en las líneas 1, 2, 8 y 10; los clones que poseen un transposón en el vector pUC19 se muestran en las líneas 3 y 4; los clones inestables que poseen un transposón en la cubierta de JE se muestran en las líneas 5-7 y 9; y en la línea 11 se muestra un marcador de 1 kilobase.

La figura 3 muestra los resultados del cartografiado mediante PCR de plásmidos mutantes selectos. Este análisis confirmó la naturaleza aleatoria de la inserción en la cubierta de JE. Las líneas 1-13 muestran los productos de la PCR de 13 clones, mientras que la línea 14 contiene un marcador de 1 kilobase.

La figura 4 muestra las secuencias de aminoácidos de cinco clones mutantes que se seleccionaron para la transfección de células Vero. Las secuencias de la cubierta de JE están en negrita, y las secuencias del inserto tras la transposición están subrayadas. Las secuencias restantes, que son conjuntos repetidos de tres aminoácidos cada uno que están en el lado izquierdo del primer guión y en el lado izquierdo del segundo guión en cada línea, son artefactos de la mutagénesis de transposones.

La figura 5 es una representación esquemática de la glucoproteína de cubierta de JE, que muestra las localizaciones de insertos con respecto a epítopos conformacionales definidos de la proteína. Las flechas ubican los sitios de inserción aproximados para 5 mutantes de la cubierta de JE independientes que se seleccionaron para la transfección de células Vero. Los números entre corchetes indican el aminoácido de la cubierta de JE que precede al inserto de 19 aminoácidos.

La figura 6 muestra los resultados del análisis mediante RT-PCR de ADNc sintetizado a partir de ARN extraído de células Vero que se han transfectado con ARN obtenido de 5 clones únicos (2 por duplicado) . Se amplificó un inserto de 1, 9 kilobases que incluye el ligador de 57 pares de bases a partir de cada uno de los clones, y se confirmó la producción de virus de progenie. En la línea 1 se fraccionó un marcador de 1 kilobase. Las líneas 2-8 corresponden al clon O-10-2, clon I-10-3, clon II-4-3, clon II-4-6, clon I-1, clon III-6, y clon IV-8-1, respectivamente.

La figura 7 muestra los resultados del análisis mediante PCR... [Seguir leyendo]

1. Vector de flavivirus, que comprende una proteína de cubierta que comprende un péptido extraño insertado en la proteína de cubierta, en el que dicho péptido extraño tiene una longitud d.

2. 55 aminoácidos, en el que dicho vector es un flavivirus quimérico que comprende las proteínas de la cápsida y no estructurales de un virus de fiebre amarilla 17D y las proteínas de premembrana y de cubierta de un virus de encefalitis japonesa SA14-14-2, y el péptido extraño está insertado en una posición de aminoácidos seleccionada de entre 59, 231, 287, 340 o 436 de la proteína de cubierta del virus de la encefalitis japonesa SA14-14-2.

2. Vector de flavivirus según la reivindicación 1, en el que dicho péptido extraño comprende un epítopo derivado de un antígeno de un patógeno vírico, bacteriano o parasitario, o un epítopo derivado de un antígeno asociado a tumor.

3. Vector de flavivirus según la reivindicación 2, en el que dicho patógeno vírico se selecciona de entre el grupo que consiste en virus de la hepatitis C, virus del papiloma, virus de la inmunodeficiencia humana, tipo I, virus de la inmunodeficiencia humana, tipo II, virus de la hepatitis B, virus del herpes simple, tipo I, virus del herpes simple, tipo II, y virus de la gripe.

4. Vector de flavivirus según la reivindicación 2, en el que dicho patógeno bacteriano es Clostridium difficile.

5. Vector de flavivirus según la reivindicación 2, en el que dicho antígeno es la proteína de cápsida L2 del virus del papiloma.

6. Composición farmacéutica, que comprende el vector de flavivirus según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5

y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. 25

7. Composición farmacéutica de la reivindicación 6, para su utilización en el suministro de un péptido a un paciente.

8. Composición farmacéutica según la reivindicación 7, en la que el péptido es un antígeno, y dicha composición es

para la administración para inducir una respuesta inmunitaria frente a un patógeno o tumor del que deriva dicho 30 antígeno.

9. Molécula de ácido nucleico que comprende el genoma del flavivirus según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o su complemento.