Procedimiento y kit para la determinación de metabolitos en muestras de manchas de sangre seca.

Un procedimiento para la determinación analítica, mediante EM,

de Adenosina y Desoxiadenosina a partir de unamuestra de sangre seca, comprendiendo dicho procedimiento la extracción de Adenosina y Desoxiadenosina enunas condiciones que permiten la extracción simultánea de otros metabolitos tales como aminoácidos, carnitina libreo acilcarnitinas, estando dicho procedimiento caracterizado por el uso de una mezcla de extracción que comprendeuna mezcla de agua y un monoalcohol C1-3 de cadena lineal o ramificada en el que el agua está presente al menosal 10 % v/v.

Procedimiento y kit para la determinación de metabolitos en muestras de manchas de sangre seca

Campo de la invención [0001] La presente invención se refiere a un procedimiento y a un kit para la determinación de metabolitos en muestras de manchas de sangre seca (como las tarjetas de Guthrie) , en particular dichos metabolitos incluyen también aquellos debidos a un defecto en la desaminasa de adenosina (ADA) o a un defecto en la fosforilasa de nucleósidos de purina (PNP) .

Antecedentes

La inmunodeficiencia combinada grave (SCID) es un grupo de enfermedades graves que afectan al sistema inmunitario. Los niños con SCID nacen sanos pero mueren por una infección grave recurrente en la infancia salvo que se proporcione una terapia adecuada. Desafortunadamente, la mayoría de los niños con SCID no son identificados en el periodo previo a la infección: el diagnóstico se hipotetiza habitualmente cuando se produce una infección grave. Sin embargo, en ese momento, aunque se inicia una intervención terapéutica correcta, ya puede haber daños presentes debidos a una infección grave (tales como meningitis, encefalitis, neumonía grave) y las secuelas permanentes pueden ser una importante carga tanto para los pacientes como para la familia y la sociedad.

El SCID debido a un defecto en la desaminasa de adenosina (ADA) o en la fosforilasa de nucleósidos de purina (PNP) es un trastorno hereditario en el metabolismo de la purina. La deficiencia genética de la enzima natural de purina ADA da como resultado unos grados variables de inmunodeficiencia que varían entre una inmunodeficiencia combinada grave de inicio neonatal hasta una inmunodeficiencia de inicio tardío que puede determinar una afectación grave de la función pulmonar en adolescentes o en adultos.

En su forma típica, la ausencia de la enzima ADA permite la acumulación de metabolitos tóxicos resultantes por un lado de un grave defecto del sistema inmunitario, y por otro lado, de un daño permanente de otros órganos y sistemas tales como el cerebro o el hígado. En estos casos, la SCID-ADA es mortal en los primeros meses de vida si no se trata, y está asociada con graves secuelas si se trata tarde.

También se ha descrito una ADA-SCID de inicio tardío. En estos casos, los pacientes experimentan infecciones graves recurrentes y enfermedad pulmonar crónica durante la infancia o la adolescencia. Las consecuencias clínicas del defecto en la PNP son muy similares.

En ambos casos, el transplante de células madre hematopoyéticas es curativo, pero depende de una buena compatibilidad con el donante. La terapia de sustitución enzimática está disponible y determina la eliminación de los metabolitos tóxicos y una buena reconstitución del sistema inmunitario. La terapia génica también es una opción para los pacientes. En cualquier caso, cualquiera que sea la terapia elegida, debería comenzar lo más pronto posible tras el nacimiento con objeto de obtener un buen efecto terapéutico. Por lo tanto, los procedimientos diagnósticos que permitan la realización de un diagnóstico seguro en los primeros días de vida son extremadamente importantes.

El diagnóstico temprano de la deficiencia en ADA es necesario porque las terapias oportunas (trasplante de 45 células madre, terapia de sustitución enzimática) pueden ser curativas, mientras que la enfermedad es rápidamente mortal si no se trata. El diagnóstico se puede realizar buscando la actividad enzimática de la ADA o la acumulación de metabolitos debida a la deficiencia en la ADA. La evaluación de la actividad de la ADA es compleja y a menudo puede aportar unos resultados engañosos: de hecho, se puede encontrar un defecto grave en la actividad de la ADA en sujetos con una función inmunitaria absolutamente normal, debido a que la actividad residual variable de la ADA expresada en células distintas a las células inmunitarias puede ser suficiente para mantener una función inmunitaria correcta. Por esta razón, la dosis de metabolitos es absolutamente obligatoria para conseguir el diagnóstico de la inmunodeficiencia debida a una deficiencia en ADA o en PNP. Además, la dosificación de metabolitos permite monitorizar la reducción de su actividad tóxica tras el comienzo de la terapia de sustitución enzimática.

La medición de los metabolitos de purina y de pirimidina presenta problemas complejos para las separaciones. Se usan diferentes procedimientos para la medición en la práctica clínica, que varían desde una HPLC hasta una cromatografía en capa fina. Otros procedimientos incluyen una electroforesis capilar e incluso una HPLC en fase inversa con espectrometría de masas en tándem con ionización por electronebulización.

Sin embargo, todos estos procedimientos se aplican sobre muestras de orina y se usan cuando ya se ha formulado una sospecha clínica de inmunodeficiencia debido al inicio de infecciones graves. Existe un serio inconveniente en los procedimientos, dado que los niños afectados deberían ser diagnosticados antes del inicio de las infecciones para maximizar la oportunidad de un tratamiento que les salve la vida. Los antecedentes familiares pueden ayudar a realizar un diagnóstico temprano, pero los datos obtenidos en los estados unidos muestran que 65 únicamente el 18 % de los pacientes afectados tienen unos antecedentes familiares positivos. El número es probablemente incluso menor en Italia, donde la mayoría de las familias únicamente tienen un hijo.

El uso de la espectrometría de masas (EM) en los laboratorios clínicos ha aumentado mucho al comienzo del siglo XXI. Este desarrollo es debido obviamente a los grandes avances en las aplicaciones de la espectrometría de masas en los últimos quince años. La espectrometría de masas permite una medición muy rápida de diferentes metabolitos en diferentes muestras biológicas mediante el uso de manchas en papel de filtro o directamente en diferentes fluidos biológicos. Debido a su elevada sensibilidad, esta técnica se puede usar para los análisis cualitativos y cuantitativos de muchos analitos tales como purinas y pirimidinas, aminoácidos y acilcarnitinas, homocisteína, ácido orótico, succinilacetona etc., con los estándares internos apropiados.

La EM se usa ampliamente para el análisis de metabolitos procedentes de manchas de sangre seca tomadas al nacer (tarjetas de Guthrie) , pero entre los metabolitos detectados, aquellos debidos a una deficiencia en la ADA no son detectados porque los procedimientos de extracción no son eficaces. El procedimiento clásico usado habitualmente para un cribado ampliado del recién nacido se realiza mediante el uso de un monoalcohol C1-3 de cadena lineal o ramificada (preferiblemente metanol) (Millington DS, y col., J Inherit Metab Dis. 1990; 13 (3) : 321 - 4; Donald H. y col. Clin. Chem., noviembre de 2003; 49: 1797 - 1817; la Marca G. y col., Rapid Commun Mass Spectrom. 2003; 17 (23) : 2688 - 92) .

El propósito de la presente invención es proporcionar un procedimiento analítico que podría permitir también la determinación de metabolitos de purina y de pirimidina (incluyendo, en particular, metabolitos por una deficiencia en ADA o en PNP) junto con la determinación de otros metabolitos que se determinan habitualmente en el cribado de metabolitos, especialmente los cribados realizados en manchas de sangre seca tomadas al nacer.

Definiciones y abreviaturas

ADA: desaminasa de adenosina Ado: adenosina D-Ado: desoxiadenosina EM: espectrometría de masas PNP: fosforilasa de nucleósidos de purina SCID: inmunodeficiencia combinada grave

Sumario de la invención [0014] El objeto de la presente invención es un procedimiento capaz de individualizar, mediante una EM, con una elevada sensibilidad y especificidad, metabolitos de purina y de pirimidina (incluyendo especialmente metabolitos por una deficiencia en ADA o en PNP) procedentes de sangre seca. El procedimiento descrito en este documento puede usarse para extraer Adenosina y Desoxiadenosina a partir de una muestra de sangre seca en unas condiciones que permiten extraer simultáneamente otros metabolitos, tales como otras purinas y pirimidinas, aminoácidos, carnitina libre o acilcarnitinas. El procedimiento de la invención se caracteriza por el uso de una mezcla de extracción que comprende una mezcla de agua y un monoalcohol C1-3 de cadena lineal o ramificada (preferiblemente metanol) en la que hay presente agua al menos al 10 % v/v. El procedimiento puede usarse, junto con otros cribados neonatales, sobre manchas de sangre seca, preferiblemente absorbidas en una tarjeta, y más preferiblemente en tarjetas de Guthrie, incluso más preferiblemente en las tarjetas de Gurthie obtenidas en el ll - IV día de vida, o durante la terapia 45 de sustitución enzimática (para... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para la determinación analítica, mediante EM, de Adenosina y Desoxiadenosina a partir de una muestra de sangre seca, comprendiendo dicho procedimiento la extracción de Adenosina y Desoxiadenosina en 5 unas condiciones que permiten la extracción simultánea de otros metabolitos tales como aminoácidos, carnitina libre o acilcarnitinas, estando dicho procedimiento caracterizado por el uso de una mezcla de extracción que comprende una mezcla de agua y un monoalcohol C1-3 de cadena lineal o ramificada en el que el agua está presente al menos al 10 % v/v.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 que se realiza añadiendo la mezcla de extracción en dos etapas: en la primera etapa se pone en contacto la muestra con el monoalcohol C 1-3 de cadena lineal o ramificada que se corresponde con e.

10. x % v/v del volumen final; en la siguiente segunda etapa se añade a la muestra agua, que se corresponde con el x % v/v del volumen final; donde x es el porcentaje de agua en v/v que varía desde el 10 hasta el 90 %.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 en el que dicho monoalcohol es metanol.

4. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3 en el que dicha mezcla de extracción

contiene u.

30. 50 % v/v de agua. 20

5. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 3 y 4 en el que la mezcla de extracción contiene un 60 % v/v de metanol y un 40 % v/v de agua.

6. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5 en el que la disolución de extracción 25 también contiene un ácido orgánico a una concentración de 1 - 5 mM.

7. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 -6 en el que la mezcla de extracción contiene uno o más estándares internos, por ejemplo, para aminoácidos, carnitina libre, acilcarnitinas y Adenosina y Desoxiadenosina, a unas concentraciones conocidas.

8. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 7 en el que después de la extracción puede determinarse la presencia o la cantidad de Adenosina y Desoxiadenosina junto con uno o más analitos adicionales (por ejemplo, carnitina libre, acilcarnitinas y aminoácidos) mediante el uso de espectrometría de masas (por ejemplo, espectrometría de masas en tándem) .

9. Un kit adecuado para el procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 8 para la preparación de muestras para la detección y/o la medición, mediante el uso de espectrometría de masas en tándem, de Adenosina y Desoxiadenosina junto con otros múltiples analitos en una muestra de sangre seca; comprendiendo dicho kit:

- al menos un recipiente que contiene como control Adenosina y Desoxiadenosina y uno o más aminoácidos, carnitina libre, o una o más acilcarnitinas o más analitos como controles adicionales o estándares internos;

- al menos un recipiente que contiene una mezcla de extracción que comprende una mezcla de agua y un

monoalcohol C1-3 de cadena lineal o ramificada en el que el agua está presente al menos al 10 % v/v. 45

10. Kit de acuerdo con la reivindicación 9 en el que hay comprendida adicionalmente al menos una mancha de sangre seca útil como control, en el que dicha mancha de sangre seca está enriquecida con Adenosina y Desoxiadenosina, uno o más aminoácidos, carnitina libre o una o más acilcarnitinas o más analitos, a unas concentraciones conocidas.

11. Un procedimiento para el diagnóstico de la SCID a partir de manchas de sangre seca, preferiblemente en tarjetas de Guthrie obtenidas en el ll - IV día de vida, o para monitorizar la eficacia de la terapia durante una terapia de sustitución enzimática, comprendiendo dicho procedimiento el procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 8 o el uso de un kit de acuerdo con la reivindicación 9.