Procedimiento para la detección electroquímica de reacciones de unión.

Procedimiento para la realización de formatos de inmunoensayo competitivo homogéneos con detección electroquímica en disolución,

caracterizado porque dos conjugados distintos se combinan como reactivos con la muestra o una mezcla de tampón de muestra, comprendiendo un conjugado un marcador rédox y una molécula de analito y comprendiendo el segundo conjugado un anticuerpo anti-marcador rédox o un fragmento del mismo que se une específicamente y una molécula que se une específicamente al analito, y porque la presencia de analito libre en la muestra permite o promueve la unión del marcador rédox al anticuerpo anti-marcador rédox, inhibiéndose ("extinguiéndose") mediante esta unión la actividad rédox del marcador rédox unido, por lo que se genera o modifica una señal detectable.

Procedimiento para la detección electroquímica de reacciones de unión.

La presente invención se refiere a un procedimiento para la detección electroquímica directa altamente sensible de reacciones de unión anticuerpo-antígeno y otras interacciones bioquímicas en disolución. El procedimiento es adecuado para inmunoensayos sin lavado y sin separación en diagnóstico, especialmente para inmunoensayos automatizados y microfluídicos. El procedimiento también es adecuado para sistemas de inmunoensayo y tiras reactivas económicas para un solo uso.

Los inmunoensayos utilizan la reacción antígeno-anticuerpo para la detección específica de las concentraciones más bajas de un analito en medios complejos tales como la sangre, el suero, la orina o alimentos. En el diagnóstico clínico, la analítica medioambiental y de alimentos, los inmunoensayos son herramientas irrenunciables desde hace décadas para la detección de las concentraciones más bajas de hormonas, metabolitos, proteínas, biomarcadores, toxinas, pesticidas, bacterias patógenas y virus. Muchos de los analitos clínicamente diagnósticos más importantes sólo son económica y rápidamente medibles con inmunoensayos, ya que no hay ningún procedimiento analíticamente químico alternativo que ofrezca una combinación equivalente de alta sensibilidad (detección de concentraciones nanomolares o más bajas) y alta especificidad (detección del analito en presencia de sustancias interferentes similarmente químicamente construidas) . Procedimientos alternativos tales como la cromatografía (por ejemplo, HPLC, cromatografías de gases) requieren una preparación de muestras de frecuentemente varias etapas, por ejemplo, mediante extracción y derivatización química.

Desde la invención del inmunoensayo hace 50 años por Rosalyn Yalow y Salomon Berson se han desarrollado múltiples modos de realización diferentes que designan distintos formatos de inmunoensayo. La diferencia fundamental de formatos heterogéneos, tales como el ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas, “enzyme linked immunosorbent assay”) , y formatos homogéneos se realiza mediante el estado de agregación del anticuerpo utilizado para la detección: en los ensayos heterogéneos, el anticuerpo (raramente el antígeno) se inmoviliza sobre una superficie (tubo de reacción, placa de microtitulación, tiras reactivas) , todas las etapas de reacción tales como etapas de lavado y separación, así como la detección, también se realizan sobre la superficie. En los formatos homogéneos no se inmoviliza ningún componente de unión, no se necesita ninguna etapa de lavado y separación, la detección también se realiza en disolución.

Otra posibilidad de diferenciación resulta del procedimiento de detección utilizado. Como la reacción de unión de anticuerpo-antígeno no puede ponerse directamente de manifiesto, uno de los componentes de unión debe acoplarse químicamente a un marcador o “marca” (“label”) molecular (excepción: biosensores sensibles a la masa basados en resonancia de plasmones superficiales, acoplador de rejilla, microbalanza de cristal de cuarzo (Quarz-Cr y stal Microbalance) , ondas acústicas de superficie (“Surface acoustic waves”) y técnicas similares miden directamente la reacción de unión molecular en tiempo real cuando uno de los componentes de unión está inmovilizado sobre la superficie sensible. Sin embargo, estos procedimientos sólo se utilizan hasta la fecha en aplicaciones de investigación, no en la analítica rutinaria) . Una marca (“label”) adecuada debe presentar una alta “actividad específica”, es decir, por molécula de marca deben producirse en la medida de lo posible muchos eventos de señalización. A las marcas más frecuentemente utilizadas pertenecen isótopos radiactivos (radioinmunoensayo, “RIA”) , colorantes fluorescentes (fluoresceína, rodamina, etc.) , nanopartículas semiconductoras fluorescentes (“puntos cuánticos” (“Quantum dots”) ) , nanopartículas poliméricas (“perlas de látex” (“Latex beads”) , inmunoensayo de aglomeración) y enzimas tales como peroxidasa, junto con un sustrato enzimático colorimétrico, fluorógeno o quimioluminiscente (ELISA) . Los isótopos radiactivos poseen la mayor actividad específica, que hace posible incluso la detección de una sola molécula de marca (“label”) . Debido al riesgo para la salud que se deriva de la radiactividad, los altos requisitos asociados a la misma en el laboratorio (“laboratorio de isótopos”) y los altos costes para la eliminación de residuos, cada vez se sustituyen más los inmunoensayos radiactivos por procedimientos alternativos tales como el ELISA.

Otra diferencia entre distintos inmunoensayos resulta del tipo de anticuerpo utilizado. Los anticuerpos son proteínas complejamente construidas con regiones constantes que determinan la estructura y están compuestas similarmente en todas las clases de anticuerpos, y regiones altamente variables que se unen a los sitios de unión a antígeno. Los sueros policlonales originariamente utilizados que contienen múltiples anticuerpos con especificidad y afinidad variable se sustituyen en muchas aplicaciones con anticuerpos monoclonales que sólo contienen exactamente una entidad de anticuerpo (“clon”) con especificidad y afinidad perfectamente definidas. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse teóricamente en cantidades discrecionales con propiedades idénticas. Además, para muchos análisis también se utilizaron los llamados fragmentos de anticuerpo, que pueden prepararse a partir de anticuerpos completos mediante digestión enzimática. Los anticuerpos monocatenarios son fragmentos de anticuerpos recombinantes que pueden prepararse mediante procedimientos de ingeniería genética. En los formatos de inmunoensayo conocidos pueden utilizarse fundamentalmente todos los tipos de anticuerpos y ligandos moleculares derivados de los mismos.

A los analitos clínicos más conocidos que se detectan con inmunoensayos pertenecen hCG (prueba de embarazo) , hormonas tiroideas tales como TSH (enfermedades de la glándula tiroides) , hormonas esteroideas (endocrinología, fertilidad) y PSA (biomarcador para carcinoma de próstata) .

En resumen, puede decirse que los inmunoensayos basados en anticuerpos monoclonales o anticuerpos policlonales figuran entre los procedimientos analítico-químicos más importantes de la biotecnología, diagnóstico clínico, analítica medioambiental y de alimentos, y poseen un alto valor comercial.

En el estado de la técnica se han descrito múltiples procedimientos para realizar un inmunoensayo. La mayoría de los inmunoensayos heterogéneos requieren varias etapas de trabajo manual tales como, por ejemplo, procesos de pipeteado, dilución de muestras, procesos de lavado que deben seguir un protocolo temporal preciso. Por tanto, generalmente se necesita personal experto y un laboratorio especialmente equipado para el mismo para realizar correctamente aquellos ensayos. Los aparatos de detección necesarios (“lector de ELISA”, de “ELISA-Reader”, lector de placas de microtitulación, analizador de inmunoensayos) son caros y no son portátiles. Así, por ejemplo, en las memorias de patente [patentes US4016043A, US3839153A] se han descrito protocolos para la realización de una prueba de ELISA. El experto aprecia fácilmente que procesos de análisis complejos sólo pueden realizarse por personal experto y sólo en un entorno de laboratorio adecuado. La automatización de aquellos procesos es muy compleja y requiere máquinas automáticas altamente complejas.

Para la utilización in situ se ha impuesto el formato de inmunoensayo de flujo lateral heterogéneo (inmunoensayo con “tiras reactivas”) . La patente US6156271A describe una moderna variante de este formato de ensayo. Esta prueba transcurre por sí sola después de la adición de la disolución de muestra, y la detección se realiza puramente visualmente (lectura por el usuario de la presencia de una o dos bandas coloreadas sobre la tira reactiva) . Es evidente que un procedimiento de lectura de este tipo no puede proporcionar resultados cuantitativos (es decir, mediciones de concentración precisas) , sino que sólo son posibles una respuesta sí/no o una respuesta semi-cuantitativa (la concentración se encuentra por debajo/por encima de un valor umbral determinado) .

El experto sabe que los inmunoensayos homogéneos son por el contrario especialmente adecuados para realizar inmunoensayos rápidos, cuantitativos y completamente automatizados. En los inmunoensayos homogéneos, la generación de señales se realiza simultáneamente a la reacción de unión.... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la realización de formatos de inmunoensayo competitivo homogéneos con detección electroquímica en disolución, caracterizado porque dos conjugados distintos se combinan como reactivos con la muestra o una mezcla de tampón de muestra, comprendiendo un conjugado un marcador rédox y una molécula de analito y comprendiendo el segundo conjugado un anticuerpo anti-marcador rédox o un fragmento del mismo que se une específicamente y una molécula que se une específicamente al analito, y porque la presencia de analito libre en la muestra permite o promueve la unión del marcador rédox al anticuerpo anti-marcador rédox, inhibiéndose (“extinguiéndose”) mediante esta unión la actividad rédox del marcador rédox unido, por lo que se genera o modifica una señal detectable.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el marcador rédox se selecciona del grupo de ferroceno y derivados de ferroceno, complejos de osmio-di-bipiridilo y otros complejos basados en osmio, complejos de rutenio-bipiridilo y otros complejos basados en rutenio, p-aminofenol, hexacianoferrato (II/III) , quinonas y otros marcadores rédox conocidos para inmunoensayos electroquímicos.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque el marcador rédox es ferrocenio y el anticuerpo anti-marcador rédox es un anticuerpo anti-ferrocenio, preferiblemente monoclonal.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque la molécula que se une específicamente al analito representa un anticuerpo anti-analito, un aptámero, un péptido, un ácido nucleico o un quelante que se une específicamente al analito.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado porque la molécula que se une específicamente al analito es un anticuerpo anti-analito o un fragmento del mismo.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque ambos conjugados comprenden moléculas de ligador solubles en agua, especialmente ligadores de PEG.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque los reactivos necesarios se añaden en forma soluble y una detección electroquímica del evento de unión se realiza en tiempo real.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque todos los reactivos necesarios se añaden como mezcla preparada a la muestra y una detección electroquímica del evento de unión se realiza en tiempo real.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque todos los reactivos necesarios se ponen a disposición como reactivos secos en un recipiente de reacción adecuado y se disuelven mediante la adición de la muestra y, dado el caso, tampón, por lo que se caracteriza el inicio del análisis.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1-9, caracterizado porque el inmunoensayo se realiza en un sistema de análisis microfluídico (laboratorio en un chip, “Lab-on-a-Chip”) y/o en un analizador completamente automático.

11. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1-10, caracterizado porque en lugar de un electrodo sencillo para la detección se utiliza un electrodo estructurado, por ejemplo, un electrodo interdigital.

12. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1-11, caracterizado porque en lugar de una sencilla reacción rédox electroquímica se utiliza una reacción cíclica enzimáticamente catalizada.

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