Composiciones que comprenden macromoléculas inmovilizadas y orientadas y métodos para su preparación.

Un método para extender y selectivamente inmovilizar un polinucleótido,

que comprende las operaciones de:

a) inmovilizar una primera porción de dicho polinucleótido sobre una superficie;

b) aplicar a dicho polinucleótido una fuerza capaz de extender dicho polinucleótido; y

c) poner una segunda porción de dicho polinucleótido en contacto con una molécula, en donde dicha molécula comprende un primer componente capaz de unirse a la segunda porción de dicho polinucleótido y un segundo componente capaz de unirse selectivamente a dicha superficie, en unas condiciones bajo las cuales dicha molécula se une selectivamente a la segunda porción de dicho polinucleótido y se une selectivamente a dicha superficie, inmovilizándose por ello selectivamente dicho polinucleótido en un estado extendido.

Composiciones que comprenden macromoléculas inmovilizadas y orientadas y métodos para su preparación.

1. Campo de la invención La presente invención está relacionada con los campos de la inmovilización macromolecular y el estiramiento macromolecular.

2. Antecedentes de la invención Las macromoléculas pueden comprender secuencias únicas de monómeros u otros componentes que se pueden utilizar para distinguir rápidamente una macromolécula de otra. Cuando una macromolécula está unida o asociada con otro elemento, ese elemento puede ser identificado por rasgos de la macromolécula. El elemento puede ser cualquier elemento evidente para quien tienen experiencia en la técnica, tal como un sustrato, una superficie, otra molécula, una posición en una matriz o cualquier otro elemento con el que se pueda asociar una macromolécula. Uno puede identificar rápidamente el elemento al identificar la macromolécula.

De los muchos rasgos de las macromoléculas, su estructura proporciona gran parte de su diversidad. En general, su estructura primaria, es decir, la secuencia de sus monómeros u otros componentes, permite distinguir una macromolécula de otra macromolécula. Sin embargo, muchas macromoléculas, si no la mayoría, comprenden además niveles de estructura, tal como una estructura secundaria, terciaria o incluso cuaternaria, que puede dificultar realmente la capacidad de un experto para identificar la estructura primaria de la macromolécula. Para ilustrar esto, una sola macromolécula que comprende una secuencia primaria de rasgos A, B, C, D, E y F puede ser fácilmente identificada si se pueden reconocer los rasgos uno detrás de otro a lo largo de la secuencia primaria. Sin embargo, si esa macromolécula estuviera enrollada, retorcida o plegada en una estructura tridimensional, como es a menudo el caso de las macromoléculas presentes en la naturaleza en disolución, podría ser que los rasgos no fueran fácilmente identificables en su secuencia apropiada. Podría ser que quien tiene experiencia en la técnica no fuera capaz de distinguir una macromolécula que tiene la estructura primaria A, B, F, C, E y D de la estructura primaria A, B, C, D, E y F a causa de la estructura secundaria o terciaria o cuaternaria.

Las personas con experiencia han desarrollado técnicas para cardar la estructura primaria de una macromolécula tridimensional. Para ciertas macromoléculas, por ejemplo, polinucleótidos y polipéptidos, las técnicas químicas para identificar la secuencia primaria de sus rasgos resultarán familiares a quienes tienen experiencia. Además, se han desarrollado unas cuantas técnicas para extender o estirar o combinar macromoléculas, para reducir la complejidad de sus estructuras y facilitar de ese modo la elucidación de la estructura primaria. En estas técnicas ha estado generalmente implicada la aplicación de cierta fuerza capaz de extender la macromolécula. En ciertas técnicas ha estado además implicada la fijación no selectiva de la macromolécula en un estado extendido, tal como, por ejemplo, al secar la macromolécula sobre una superficie.

Los métodos y composiciones que faciliten la identificación de la estructura primaria de una macromolécula potenciarán además su utilidad en los campos del reconocimiento macromolecular y el etiquetado macromolecular y en otros campos.

Chiou y Lee, J. Micromech. Microeng. 15: 109-117 (2005) , describen el estiramiento de una molécula de DNA con un extremo enlazado a un glóbulo magnético y el otro extremo enlazado a una superficie de oro.

Ferree y Blanch, Biophysical Journal 87: 468-75 (2004) , utilizan DNA atado por un extremo para examinar la hidrodinámica del estiramiento y la relajación electroforéticas de DNA en una disolución de polímero.

Wang et al., Biophysical Journal 72: 1335-46 (1997) , describen la inmovilización de un extremo de una molécula de DNA sobre la superficie de un portaobjetos y el otro extremo sobre un glóbulo microscópico para determinar relaciones de fuerza-extensión para moléculas de DNA.

3. Sumario de la invención La presente descripción proporciona métodos y composiciones que facilitan la identificación de estructuras primarias de una diversidad de macromoléculas. De acuerdo con la invención, se proporciona un método para extender y selectivamente inmovilizar un polinucleótido, que comprende las operaciones de:

a) inmovilizar una primera porción de dicho polinucleótido sobre una superficie;

b) aplicar a dicho polinucleótido una fuerza capaz de extender dicho polinucleótido; y

c) poner una segunda porción de dicho polinucleótido en contacto con una molécula, en donde dicha molécula comprende un primer componente capaz de unirse a la segunda porción de dicho polinucleótido y un segundo componente capaz de unirse selectivamente a dicha superficie, en unas condiciones bajo las cuales dicha molécula se une selectivamente a la segunda porción de dicho polinucleótido y se une selectivamente a dicha superficie, inmovilizándose por ello selectivamente dicho polinucleótido en un estado extendido. Es digno de mención que se puede inmovilizar selectivamente una macromolécula mientras está totalmente extendida bajo cualquiera que sea la fuerza que se utilice para la extensión. También se describen en esta memoria métodos que facilitan la inmovilización selectiva de macromoléculas extendidas que están orientadas entre sí. En otras palabras, se puede inmovilizar fácilmente una pluralidad de macromoléculas con la misma orientación entre sí.

La presente invención proporciona un método para extender y selectivamente inmovilizar un polinucleótido en un estado extendido. En general, se inmoviliza una primera porción de la macromolécula mediante cualquier técnica conocida por quienes tienen experiencia en este campo técnico. La primera porción de la macromolécula puede ser inmovilizada selectiva o no selectivamente. La primera porción puede ser inmovilizada mediante uno o más enlaces covalentes o mediante uno o más enlaces no covalentes. En las secciones posteriores se describen primeras porciones inmovilizadas ejemplares.

Con una primera porción inmovilizada, el polinucleótido puede ser extendido mediante cualquier técnica para extender una macromolécula, evidente para quienes tienen experiencia en la técnica. El polinucleótido puede ser extendido mediante la aplicación de una fuerza capaz de extender el polinucleótido. La fuerza puede ser cualquier fuerza evidente para quien tiene experiencia en la técnica para extender el polinucleótido. Las fuerzas ejemplares incluyen la gravedad, fuerza hidrodinámica, fuerza electromagnética y combinaciones de las mismas. En las secciones posteriores se describen técnicas específicas para extender el polinucleótido.

El polinucleótido está en un estado extendido si es reconocido como extendido por quien tiene experiencia en la técnica. El polinucleótido está en un estado extendido cuando está en el campo de una fuerza capaz de extender el polinucleótido o cuando su radio hidrodinámico medio es más del doble del radio hidrodinámico medio del polinucleótido en su estado nativo, según es reconocido por quien tiene experiencia en la técnica.

El método de la invención comprende la operación de inmovilizar selectivamente una segunda porción del polinucleótido mientras está en un estado extendido. Esto puede dar lugar a un polinucleótido inmovilizado que esté extendido entre las porciones primera y segunda. Es digno de mención que, puesto que el polinucleótido es selectivamente inmovilizado mientras está extendido, se puede conservar esa extensión en el polinucleótido inmovilizado. En general, la primera porción y la segunda porción del polinucleótido no son la misma.

La inmovilización selectiva puede ser de acuerdo con cualquier técnica para la inmovilización selectiva de una porción de un polinucleótido, evidente para quienes tienen experiencia en la técnica. La inmovilización selectiva puede ser por medio de, por ejemplo, la formación de uno o más enlaces covalentes o uno o más enlaces no covalentes, o ambos. En las secciones posteriores se describen ejemplos particulares de técnicas para inmovilización selectiva. Se pueden utilizar uno o más pares ligantes para inmovilizar la segunda porción de la macromolécula.

El sustrato de inmovilización puede ser cualquier sustrato que se considere útil para la inmovilización, conocido por quienes tienen experiencia en la técnica. Los sustratos útiles incluyen superficies, membranas, glóbulos, materiales porosos, electrodos, matrices y cualquier otro sustrato evidente para quienes tienen experiencia en la técnica.

La presente descripción proporciona composiciones que comprenden... [Seguir leyendo]

1. Un método para extender y selectivamente inmovilizar un polinucleótido, que comprende las operaciones de:

a) inmovilizar una primera porción de dicho polinucleótido sobre una superficie;

b) aplicar a dicho polinucleótido una fuerza capaz de extender dicho polinucleótido; y

c) poner una segunda porción de dicho polinucleótido en contacto con una molécula, en donde dicha molécula comprende un primer componente capaz de unirse a la segunda porción de dicho polinucleótido y un segundo componente capaz de unirse selectivamente a dicha superficie, en unas condiciones bajo las cuales dicha molécula se une selectivamente a la segunda porción de dicho polinucleótido y se une selectivamente a dicha superficie, inmovilizándose por ello selectivamente dicho polinucleótido en un estado extendido.

2. Una superficie que comprende un polinucleótido extendido y selectivamente inmovilizado, preparado de acuerdo con la Reivindicación 1.

3. El método de la Reivindicación 1, en donde dicho polinucleótido inmovilizado está extendido entre la primera porción y la segunda porción.

4. El método de la Reivindicación 1, en donde la primera porción de dicho polinucleótido es selectivamente inmovilizada.

5. El método de la Reivindicación 1, que comprende además la operación de inmovilizar selectivamente la primera porción de dicho polinucleótido extendido, antes de la operación de inmovilizar selectivamente la segunda porción.

6. El método de la Reivindicación 1, en donde la superficie comprende dicho segundo componente de la molécula para la inmovilización selectiva del polinucleótido.

7. El método de la Reivindicación 1, en donde dicho primer componente de la molécula es seleccionado del grupo que consiste en ligandos, antígenos, carbohidratos, ácidos nucleicos, receptores, lectinas, anticuerpos, biotina, digoxigenina, FITC, avidina, estreptavidina, anti-digoxigenina y anti-FITC.

8. El método de la Reivindicación 1, en donde dicho segundo componente de la molécula es seleccionado del grupo que consiste en ligandos, antígenos, ácidos nucleicos, receptores, anticuerpos, biotina, digoxigenina, FITC, avidina, estreptavidina, anti-digoxigenina y anti-FITC.

9. El método de la Reivindicación 1, en donde dicha primera porción del polinucleótido comprende un primer componente de una molécula que es capaz de unirse selectivamente con el segundo componente de dicha molécula para inmovilizar selectivamente dicha primera porción del polinucleótido.

10. El método de la Reivindicación 1, en donde el primer componente se une no covalentemente a dicho polinucleótido o en donde el primer componente se une covalentemente a dicho polinucleótido.

11. El método de la Reivindicación 10, en donde la superficie comprende dicho segundo componente de la molécula para la inmovilización selectiva del polinucleótido.

12. El método de la Reivindicación 11, en donde dicho primer componente de la molécula es seleccionado del grupo que consiste en ligandos, antígenos, carbohidratos, ácidos nucleicos, receptores, lectinas y anticuerpos, biotina, digoxigenina, FITC, avidina, estreptavidina, anti-digoxigenina y anti-FITC.

13. El método de la Reivindicación 11, en donde dicho segundo componente de la molécula es seleccionado del grupo que consiste en ligandos, antígenos, ácidos nucleicos, receptores y anticuerpos, biotina, digoxigenina, FITC, avidina, estreptavidina, anti-digoxigenina y anti-FITC.

14. El método de la Reivindicación 4, en donde la inmovilización selectiva es a través de uno o más enlaces no covalentes o en donde la inmovilización selectiva es a través de uno o más enlaces covalentes.

15. El método de la Reivindicación 4, en donde dicha segunda porción del polinucleótido comprende el primer componente que es capaz de reaccionar selectivamente con el segundo componente para inmovilizar selectivamente dicha segunda porción del polinucleótido.

16. El método de la Reivindicación 15, en donde la superficie comprende dicho segundo componente de la molécula para la inmovilización selectiva del polinucleótido.

17. El método de la Reivindicación 16, en donde dicho primer componente y/o dicho segundo componente son seleccionados del grupo que consiste en succinamidas, aminas, aldehídos, epóxidos y tioles.

18. El método de la Reivindicación 1, en donde dicha fuerza es seleccionada del grupo que consiste en gravedad, fuerza electromagnética y fuerza hidrodinámica.

19. El método de la Reivindicación 1, en donde dicha fuerza es un potencial eléctrico.

20. El método de la Reivindicación 18, en donde dicha fuerza es la gravedad o en donde dicha fuerza es fuerza 5 hidrodinámica.

21. El método de la Reivindicación 1, en donde dicho polinucleótido es de hebra sencilla o en donde dicho polinucleótido comprende múltiples hebras complementarias o en donde dicho polinucleótido comprende dos hebras complementarias o en donde dicho polinucleótido comprende tres hebras complementarias.

22. El método de la Reivindicación 1, en donde dicho polinucleótido es ácido desoxirribonucleico o ácido 10 ribonucleico.

23. El método de la Reivindicación 1, en donde la segunda porción es un extremo de dicho polinucleótido.

24. El método de la Reivindicación 1, en donde la primera porción es un extremo de dicho polinucleótido.

25. El método de la Reivindicación 1, en donde la primera porción y la segunda porción son extremos de dicho polinucleótido.

26. El método de la Reivindicación 1, en donde dicha segunda porción y/o dicha primera porción no es un extremo de dicho polinucleótido.

27. El método de la Reivindicación 1, en donde se inmovilizan selectivamente una pluralidad de porciones, además de la primera porción, de dicho polinucleótido extendido.

28. El método de la Reivindicación 1, que comprende además inmovilizar selectivamente una tercera porción de 20 dicho polinucleótido extendido.

29. El método de la Reivindicación 1, en donde la fuerza es capaz de orientar el polinucleótido.