Cepa viva atenuada de Actinobacillus pleuropneumoniae.

Cepa viva atenuada de Actinobacillus pleuropneumoniae.

La presente invención se refiere a una cepa viva atenuada de Actinobacillus pleuropneumoniae que comprende una modificación en al menos uno de los segmentos del gen apxIIA que codifican para los dominios transmembrana de la exotoxina ApxII y una modificación en al menos uno de los segmentos del gen apxIIIA que codifican para los dominios transmembrana de la exotoxina ApxIII.

Dicha cepa es inmunógena, no hemolítica y no citolítica. También se refiere a un procedimiento para obtenerla, a una vacuna contra la pleuroneumonía porcina que la contiene, y a un kit vacunal.

CEPA VIVA ATENUADA DE ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE

Campo de la técnica La presente invención está enmarcada en el ámbito del desarrollo de vacunas contra la pleuroneumonía porcina. En particular, se refiere a vacunas basadas en cepas vivas atenuadas de Actinobacillus pleuropneumoniae.

Estado de la técnica anterior

Actinobacillus pleuropneumoniae (en adelante, "App") es una bacteria Gram-negativa causante de la pleuroneumonía porcina, enfermedad infecciosa respiratoria, de distribución mundial, responsable de grandes pérdidas económicas en la industria porcina.

Los factores de virulencia más importantes de App son proteínas extracelulares: las exotoxinas Apx. Estas exotoxinas pertenecen a la familia de toxinas formadoras de poros denominadas RTX, ampliamente distribuidas entre las bacterias patógenas Gram-negativas. Las principales exotoxinas en App son las siguientes: ApxI, ApxII, ApxIII, y ApxIV.

Si bien todos los serotipos analizados son capaces de producir ApxIV, existe una distribución característica de serotipo para la expresión del resto de exotoxinas Apx. Los serotipos 1, 5, 9 y 11 producen las exotoxinas ApxI y ApxII; los serotipos 10 y 14 producen tan sólo la ApxI; los serotipos 7, 12 y 13 producen solamente la ApxII y los serotipos 2, 3, 4, 6, 8 y 15 producen la ApxII y la ApxIII.

Los genes correspondientes a las exotoxinas ApxI, ApxII y ApxIII están organizados en forma de operón.

El operón de las exotoxinas ApxI y ApxIII dispone de cuatro genes. El gen A (apxIA o apxIIIA) codifica para la exotoxina propiamente dicha. El gen C (apxIC o apxIIIC) codifica para una proteína activadora (acilasa) que se encarga de introducir una modificación post-traduccional en la exotoxina que permite que la misma adquiera la conformación activa, capacitándola para la interacción con los receptores celulares específicos del huésped. Los genes B y D (apxIB y apxID o apxIIIB y apxIIID) codifican para dos proteínas de membrana que se encargan de secretar las correspondientes exotoxinas maduras al medio externo.

El operón de la exotoxina ApxII dispone sólo del gen A (apxIIA) y del gen C (apxIIC) , que codifican respectivamente para la ApxII y para la proteína activadora. La exportación de la ApxII madura al medio externo se realiza gracias a las proteínas codificadas por los genes apxIB y apxID, o bien por los genes apxIIIB y apxIIID.

Las exotoxinas ApxI, ApxII y ApxIII presentan diferencias funcionales y estructurales entre ellas, tal como se describe en el artículo de Jansen et al., Infect. Immun., 1993, 61 (3) , 947-954. Si bien a nivel de la secuencia de aminoácidos las exotoxinas ApxI y ApxII presentan un bajo nivel de identidad, ambas presentan actividad hemolítica y están relacionadas inmunológicamente. La exotoxina ApxI presenta una actividad hemolítica fuerte, mientras que la actividad hemolítica de la ApxII es débil. En el mismo artículo también se describe que, por el contrario, la exotoxina ApxIII difiere de ApxI y ApxII en varios aspectos, entre ellos desde el punto de vista inmunológico y en cuanto a la actividad biológica, ya que dicha exotoxina ApxIII no es hemolítica y es fuertemente citotóxica.

En el estado de la técnica se han descrito diferentes soluciones técnicas para abordar el problema de la pleuroneumonía porcina.

Por ejemplo, en la solicitud de patente WO-A-2004/045639 se describe una vacuna que comprende una cepa viva atenuada de App de serotipo 1 que produce las toxinas ApxI y ApxII sustancialmente exentas de actividad hemolítica, pero con una gran capacidad inmunológica. Dicha vacuna resulta apropiada para proteger frente a las infecciones causadas por bacterias de App que producen las exotoxinas ApxI y/o ApxII.

También se han propuesto numerosas vacunas vivas atenuadas basadas en cepas de App sin capacidad hemolítica, que son menos inmunoprotectivas porque han sufrido modificaciones en su estructura que no les permiten unirse al receptor de membrana de las células diana o porque no pueden generar anticuerpos frente a las toxinas al no ser secretadas por la célula.

Por ejemplo, en el artículo de Tascón et al., Mol. Microbiol., 1994, 14, 207216, se describen dos mutantes de App: uno de ellos tiene una disrupción en el gen apxIBD y el otro una disrupción en el gen estructural apxIA.

En el artículo de Jansen et al., Infect. Immun., 1995, 63, 27-37, se describe la producción de mutantes de App que tienen el gen apxIA inactivado por inserción del gen CMr y/o el gen apxIIA inactivado por inserción del gen TETr.

En Reimer et al., Microb. Pathog., 1995, 18, 197-209 se describe un mutante avirulento de App que no sintetiza la toxina ApxI, pero sí la ApxII, aunque no la secreta de la célula, debido a deleciones que afectan partes importantes del operón apxIABCD.

En la solicitud de patente europea EP-A-0810283 se describe una bacteria viva atenuada que produce una toxina RTX de la familia de las Pasteurellaceae en una forma no activada.

En la solicitud de patente europea EP-A-0861319 se describe la obtención de una cepa vacunal de App modificada que produce una toxina Apx inactivada parcial o totalmente debido a la deleción parcial del gen estructural apxIA y/o a la deleción parcial de un gen activador apxIIC.

En la solicitud de patente europea EP-A-0875574 se describe una bacteria viva atenuada de la especie App que produce la toxina ApxIV en una forma no funcional.

En el artículo de C. T. Prideaux, The 16th International Pig Veterinar y Society Congress, Melbourne, Australia, 17-20 Sept. 2000, p. 439-442, se describe una vacuna preparada a partir de una cepa que tiene inactivado el gen apxIIC y que expresa y secreta una toxina ApxII no activada, incapaz, por tanto, de unirse a las células diana.

En el artículo de Lin et al., FEMS Microbio. Lot., 2007, 274, 55-62, se describe la construcción de una cepa de App doble mutante que secreta formas inactivadas de ApxI y ApxII, mediante la deleción de los genes apxIC y apxIIC de una cepa virulenta de App.

En el artículo de Park et al., J. Vet. Med. Sci., 2009, 71 (19) , 1317, se describe una cepa de App serotipo 2 que tiene inactivados los genes apxIIIB y apxIIID, responsables de la secreción de las exotoxinas.

Alternativamente se han desarrollado vacunas por subunidades basadas en toxinas de App preparadas in vitro, tal como se describe a continuación.

En la solicitud de patente europea EP-A-0453024 se describe una vacuna por subunidades que comprende las tres exotoxinas ApxI, ApxII y ApxIII además de una proteína de la membrana externa de 42 kD purificada de una cepa de App de serotipo 1.

En el artículo de Shao et al., Acta Vet. Scand., 2010, 52, 52 se describen los resultados obtenidos con una vacuna multicomponente de subunidades que comprende rApxI, rApxII, rApxIII y rOMP.

En el artículo de Sjölund et al., Acta Vet. Scand., 2010, 52, 23, se describen diferentes estrategias vacunales para hacer frente a las infecciones de App en las que se emplea una vacuna que contiene tres exotoxinas inactivadas (ApxI, ApxII y ApxIII) y una proteína de membrana exterior (OMP) de 42 KDa. En dicho artículo se pone de relieve que es necesario administrar tres dosis vacunales para llegar a proteger el animal a lo largo de todo el período de engorde hasta las 24 semanas.

Sin embargo, tal como se describe en la patente norteamericana US6013266, las vacunas por subunidades presentan varios inconvenientes entre los que se encuentran: la necesidad de disponer de cantidades elevadas de material inmunogénico para desencadenar el sistema inmunitario de forma adecuada; diversos antígenos se liberan solamente in vivo, y no pueden estar presentes en las vacunas por subunidades, y una bacteria patogénica viva tiene diversas moléculas inmunogénicas como las proteínas de la membrana externa y los polisacáridos capsulares, que también debieran estar incluidas en una vacuna por subunidades efectiva.

Además, según se describe en el artículo de revisión de Ramjeet et al., Animal Health Research Reviews., 2008, 9 (1) , 25-45, el desarrollo de una vacuna por subunidades no es una tarea fácil, ya que requiere el descubrimiento de antígenos altamente inmunogénicos, y está estrechamente ligado al uso de adyuvantes apropiados para estimular el sistema inmunológico del huésped.

Subsiste pues la necesidad de disponer de nuevas vacunas basadas en cepas vivas atenuadas que permitan obtener una protección eficaz frente a infecciones causadas por App, extender la protección frente a otros serotipos de dicha bacteria y conseguir una duración de la inmunidad a lo largo de todo el período de engorde.

Explicación de la invención El objeto de la presente invención...

R E I V I N D I C A C IO N E S

1. Una cepa viva atenuada de Actinobacillus pleuropneumoniae caracterizada porque comprende: a) una modificación en al menos uno de los tres segmentos del gen apxIIA que codifican para los dominios transmembrana de la exotoxina ApxII y

b) una modificación en al menos uno de los tres segmentos del gen apxIIIA, que codifican para los dominios transmembrana de la exotoxina ApxIII.

2. Una cepa según la reivindicación 1, caracterizada porque comprende: a) una deleción en al menos uno de los tres segmentos del gen apxIIA que codifican para los dominios transmembrana de la exotoxina ApxII y b) una deleción en al menos uno de los tres segmentos del gen apxIIIA, que codifican para los dominios transmembrana de la exotoxina ApxIII.

3. Una cepa según la reivindicación 2, caracterizada porque comprende:

a) una deleción en el segmento del gen apxIIA que codifica para el segundo dominio transmembrana de la exotoxina ApxII definido por los nucleótidos 886 a 945 del gen apxIIA y

b) una deleción en el segmento del gen apxIIIA que codifica para el segundo dominio transmembrana de la exotoxina ApxIII definido por los nucleótidos 919 a 978 del gen apxIIIA.

4. Una cepa según la reivindicación 3, caracterizada porque comprende: a) la deleción de los nucleótidos 886 a 945 del gen apxIIA que codifican para el segundo dominio transmembrana de la exotoxina ApxII y b) la deleción de los nucleótidos 919 a 978 del gen apxIIIA que codifican para el segundo dominio transmembrana de la exotoxina ApxIII.

5. La cepa de Actinobacillus pleuropneumoniae depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo con el número de registro CECT 7903.

6. Un procedimiento para obtener una cepa viva atenuada de Actinobacillus pleuropneumoniae a partir de una cepa de A. pleuropneumoniae, caracterizado porque comprende: a) modificar al menos uno de los tres segmentos del gen apxIIA que codifican para los dominios transmembrana de la exotoxina ApxII y b) modificar al menos uno de los tres segmentos del gen apxIIIA, que codifican para los dominios transmembrana de la exotoxina ApxIII.

7. Un procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado porque comprende: a) introducir una deleción en al menos uno de los tres segmentos del gen apxIIA que codifican para los dominios transmembrana de la exotoxina ApxII e b) introducir una deleción en al menos uno de los tres segmentos del gen apxIIIA, que codifican para los dominios transmembrana de la exotoxina ApxIII.

8. Un procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado porque comprende: a) introducir una deleción en el segmento del gen apxIIA, que codifica para el segundo dominio transmembrana de la exotoxina ApxII definido por los nucleótidos 886 a 945 del gen apxIIA e b) introducir una deleción en el segmento del gen apxIIIA, que codifica para el segundo dominio transmembrana de la exotoxina ApxIII definido por los nucleótidos 919 a 978 del gen apxIIIA.

9. Un procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque comprende: a) introducir la deleción del segmento del gen apxIIA, que codifica para el segundo dominio transmembrana de la exotoxina ApxII definido por los nucleótidos 886 a 945 del gen apxIIA e b) introducir la deleción del segmento del gen apxIIIA, que codifica para el segundo dominio transmembrana de la exotoxina ApxIII definido por los nucleótidos 919 a 978 del gen apxIIIA.

10. Una vacuna contra la pleuroneumonía porcina caracterizada porque comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de la cepa viva atenuada de Actinobacillus pleuropneumoniae de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

11. Una vacuna contra la pleuroneumonía porcina caracterizada porque comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de la cepa viva atenuada de Actinobacillus pleuropneumoniae de la reivindicación 5.

12. Una vacuna según la reivindicación 10 ó 11, caracterizada porque comprende la cepa en forma liofilizada o congelada.

13. Una vacuna según la reivindicación 12, caracterizada porque comprende además uno o más de un excipiente farmacéuticamente aceptable.

14. Una vacuna según la reivindicación 13, caracterizada porque el excipiente farmacéuticamente aceptable se selecciona de entre el grupo formado por povidona, trehalosa, glicerina, manitol, glucosa, dextrosa, maltosa, sorbitol, lactosa, fructosa, sacarosa, glutamato sódico, glicina, gelatina, dextrano, hidroxietilalmidón, y mezclas de los mismos.

15. Una vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, caracterizada porque comprende además un adyuvante.

16. Una vacuna según la reivindicación 15, caracterizada porque el adyuvante se selecciona de entre el grupo formado por hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, óxido de aluminio, vitamina E, escualano, escualeno, aceite vegetal, saponinas, ginseng, zymosán, glucanos, dimetilaminoetildextrano, dextranos, polímeros no iónicos en bloque, adyuvante de Freund completo, adyuvante de Freund incompleto, muramildipéptidos, y mezclas de los mismos.

17. Una vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 16, caracterizada porque comprende además como segundo componente una cantidad inmunológicamente efectiva de uno o más de un antígeno que es diferente del antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y que son capaces de

inducir o de contribuir a la inducción de una respuesta protectora frente enfermedades o condiciones patológicas que pueden afectar a los cerdos.

18. Una vacuna según la reivindicación 17, caracterizada porque el segundo componente se selecciona de entre el grupo de antígenos que proporcionan protección frente a Actinobacillus sp., Brachyspira sp., Pasteurella multocida, Salmonella sp., Streptococcus sp., Isospora sp., Er y sipelothrix rhusiopathiae, Leptospira sp., Staphylococcus sp., Haemophilus parasuis, Bordetella bronchiseptica, Mycoplasma sp., Lawsonia intracellularis, Escherichia coli, virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino, virus de la gripe porcina, virus de la gastroenteritis transmisible, parvovirus porcino, virus de la encefalomiocarditis, coronavirus, y circovirus.

19. Una vacuna según la reivindicación 18, caracterizada porque el segundo componente es la cepa depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo con el número de registro CECT 5994.

20. Kit vacunal caracterizado porque comprende un recipiente que comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de la cepa viva atenuada de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

21. Kit vacunal según la reivindicación 20, caracterizado porque comprende la cepa en forma liofilizada o congelada.

22. Kit vacunal según cualquiera de las reivindicaciones 20 ó 21, caracterizado porque comprende además un recipiente que comprende un vehículo líquido farmacéuticamente aceptable.

23. Kit vacunal según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, caracterizado porque comprende además una cantidad inmunológicamente efectiva de uno o más de un antígeno diferente de la cepa de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, capaces de inducir o de contribuir a la inducción de una respuesta protectora frente enfermedades o a condiciones patológicas que pueden afectar a los cerdos, en

donde los antígenos se encuentran en un mismo recipiente o en recipientes separados.

24. Kit vacunal según la reivindicación 23, caracterizado porque el antígeno diferente es la cepa depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo con el número de registro CECT 5994.

FIGURA 1