SECUENCIA DE NUCLEOTIDO Y PROTEINA B-GALACTOSIDASA DE STREPTOCOCCUS MITIS, PROCEDIMIENTO DE OBTENCION Y SUS APLICACIONES.

Secuencia de nucleótido y proteína {be}-galactosidasa de Streptococcus mitis,

procedimiento de obtención y sus aplicaciones.

La presente invención describe una proteína inédita {be}-galactosidasa de Streptococcus mitis que presenta motivos de unión a colina en su estructura y que no se inhibe en presencia de elevadas concentraciones de glucosa. También se·describen dos procedimientos de purificación de {be}-galactosidasas modificadas en un hospedador heterólogo (Escherichia coli).

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200802310.

Solicitante: CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS (CSIC) (Titular al 80%).

Nacionalidad solicitante: España.

Inventor/es: GARCIA LOPEZ,JOSE LUIS, GARCIA GONZALEZ,PEDRO, CAMPUZANO RUIZ,SUSANA, LLULL PEÑALBA,DANIEL, SERRA FERNANDEZ,BEATRIZ, PINGARRON CAZARRON,JOSE MANUEL.

Fecha de Publicación: 14 de Junio de 2012.

Clasificación Internacional de Patentes:

C12N15/56 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › que actúan sobre compuestos glicosílicos (3.2), p. ej. amilasa, galactosidasa, lisozima.
C12N9/38 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › actúan sobre los enlaces beta-galactosa-glicósido, p. ej. beta-galactosidasa.

PDF original: ES-2352704_A1.pdf

Fragmento de la descripción:

Secuencia de nucleótido y proteína β-galactosidasa de Streptococcus mitis, procedimiento de obtención y sus aplicaciones.

Sector de la técnica

Sector biotecnológico con aplicaciones en la industria agroalimentaria, al análisis de carbohidratos y a la biosíntesis de oligosacáridos, y más concretamente tecnología enzimática aplicada a los productos lácteos.

Estado de la técnica

La β-D-galactosidasa (EC 3.2.1.23) (en lo sucesivo β-galactosidasa), también llamada lactasa, tiene como función primaria la hidrólisis de la lactosa en D-galactosa y D-glucosa. Por ello, la aplicación fundamental de las β-D-galactosidasas se circunscribe por lo general al ámbito de los productos y subproductos lácteos [Pivarnik, L.F.; Senecal, A.G. y Rand, A.G. 1995. "Hydrolytic and transgalactosylic activities of commercial β-galactosidase (lactase) in food processing". Adv. Food Nutrit. Res. 38, 1-102]. Además, esta enzima posee actividad transgalactosilasa y se utiliza para la síntesis de galactosil-oligosacáridos, compuestos con un interés creciente en el área agroalimentaria y farmacéutica.

Como alternativa no enzimática a la hidrólisis con β-galactosidasas se puede utilizar la hidrólisis química, pero produce efectos no deseables (p. ej.: pérdida de nutrientes, defectos organolépticos, etc.) [Gekas, V. y López-Leiva, M. 1985. "Hydrolysis of lactose: A literature review". Process. Biochem. 20, 1-12].

Las β-galactosidasas se emplean en la industria agroalimentaria para reducir el contenido en lactosa de productos lácteos y derivados, lo que tiene un interés muy variado. En primer lugar, el problema más complejo sería hacer accesibles estos alimentos a los afectados de hipolactasia, que constituyen el 70% de la población mundial, para lo que necesitaremos hidrolizar el 100% de la lactosa de la leche [Savaiano, D.A. y Kotz, C. 1988. "Recent advances in the management of lactose intolerance". Contemp. Nutr. 13,10; Wolin, M.J. 1981. "Fermentation in the rumen and human large intestine". Science 213, 1463-1468; Phillips, M.C. y Briggs, G.M. 1975. "Milk and its role in the American diet". J. Dairy Sci. 58, 1751-1763; Birge, S.J.; Keutmann, H.T.; Cuatrecases, P. y Whedon, G.D. 1963. "Osteoporosis, intestinal lactase deficiency and low dietary calcium intake". N. Engl. J. Med. 276, 445-448].

En las demás utilizaciones, la exigencia de hidrólisis totales puede estar disminuida. Por ejemplo, el uso de β-galactosidasas para revalorizar los sueros de lechería mediante su transformación en jarabes de glucosa-galactosa [Mahoney, R.R. 1985. "Modification of lactose and lactose-containing dairy products with β-galactosidase". En "Developments in Dairy Chemistry: Lactose and minor constituents". Fox, F. (Ed), pp.69-108. Elsevier, Nueva York; Short, J.L. 1975. ``Prospects for the utilization of deproteinated whey in New Zealand-A review. N.Z.J. Dairy Sci. Technol. 13,181-194], evitando lo que -por otra parte- sería un grave problema medioambiental, debido a la alta demanda bioquímica de oxígeno de la lactosa de los mencionados sueros, y dado que sólo se procesa la mitad del que se produce vertiéndose el resto a los cauces fluviales [Pivarnik, L.F.; Senecal, A.G. y Rand, A.G. 1995. "Hydrolytic and transgalactosylic activities of commercial β-galactosidase (lactase) in food processing". Adv. Food Nutrit. Res. 38, 1-102] (para hacernos una idea del problema, 1 Kg de queso requiere, como media, 10 L de leche).

Por otro lado, leches con la lactosa hidrolizada son mejores sustratos para la fermentación, de forma que este proceso tiene interés para acelerar la producción de derivados fermentados de la leche (quesos, yogures...). También es interesante considerar que la lactosa tiene una solubilidad reducida cuando se la compara con la de la galactosa y glucosa, con lo que su hidrólisis evita problemas de aparición de cristales de lactosa en leches condensadas, helados, etc, además de añadir un sabor dulce al alimento.

Otra aplicación no hidrolítica sino transglicosílica, sería en la industria alimentaria y farmacéutica: síntesis de galactosil-oligosacáridos por transglicosilación [Zárate, S. y López-Leiva, M.H. 1990. "Oligosaccharide formation during enzymatic lactose hidrolysis: A literatura review". J. Food Prot. 53, 262-268], pudiendo emplearse con fines de interés alimentario [Pivarnik, L.F.; Senecal, A.G. y Rand, A.G. 1995. "Hydrolytic and transgalactosylic activities of commercial β-galactosidase (lactase) in food processing". Adv. Food Nutrit. Res. 38, 1-102] y farmacéutico [Nilsson K.G.I. 1988 "Enzymatic synthesis of oligosaccharides" Trends Biotechnol, 6, 256-264].

Una propiedad importante que ha recibido poca atención en la literatura es el nivel de pureza de las preparaciones comerciales de β-galactosidasas, especialmente en lo relacionado a la presencia de otras enzimas, como las proteasas. Estos posibles contaminantes pueden tener un impacto severo en la estabilidad de la enzima, provocando cambios indeseables en los productos lácteos durante su almacenamiento. La elevada afinidad del dominio de unión a colina por este aminoalcohol o sus análogos estructurales tales como el dietilaminoetanol (DEAE) (J.M. Sanz, R. López, J.L. García "Structural requirements of choline derivatives for "conversión" of pneumococcal amidase A new single-step procedure for purification of this autolysin" FEBS Letters 232 (1988) 308-312) permite aumentar la pureza de la β-galactosidasa recombinante de Streptococcus mitis mediante cromatografía de afinidad de DEAE-celulosa (A. Vian, A.V. Carrascosa, J.L. García, E. Cortés. "Structure of the β-galactosidase gene from Thermus sp T2: Expression in Escherichia coli and purification in a single step of an active fusión protein". Applied and Environmental Microbiology 64 (1998) 2187-2191).

Teniendo en cuenta las ventajas que el dominio de unión a colina ofrece para la purificación de enzimas se ha reportado previamente la fusión de diversas β-galactosidasas a dominios de unión a colina:

• β-galactosidasa de Escherichia coli fusionada al dominio de unión a colina de N-acetilmuramoil-L-alanina amidasa (C-LYTA) de Streptococcus pneumoniae (J. Madoz, B.A. Kuznetzov, F.J. Medrano, J.L. García, V.M. Fernández ``Functionalization of Gold Surfaces for Specific and Reversible Attachment of a Fused β-Galactosidase and Choline-Receptor Protein J. Am. Chem. Soc. 119 (1997) 1043-1051).

• β-galactosidasa de E. coli con el dominio de unión a colina de la amidasa autolítica de neumococo, LytA, fusionada a su región N-terminal (J.M. Sánchez-Puelles, J.M. Sanz, J.L. García, E. García "Immobilization and single-step purification of fusión proteins using DEAE-cellulose" Eur. J. Biochem. 203 (1992) 153-159),

• β-galactosidasa termoestable de Thermus sp. Strain T2 fusionada al dominio de unión a colina de la principal autolisina de neumococo (A. Vián, A.V. Carrascosa, J.L. García, E. Cortés. "Structure of the β-galactosidase gene from Thermus sp T2: Expression in Escherichia coli and purification in a single step of an active fusión protein" Applied and Environmental Microbiology 64 (1998) 2187-2191).

• Patente española nº 9701759 (7 de Agosto de 1997): "Un procedimiento para producir β-galactosidasa de Thermus sp. (Cepa T2) en células hospedantes, y purificarla en un sólo paso cromatográfico". Inventores: A. Vián; A.V. Carrascosa; J.L García y E. Cortés.

Descripción

La presente invención se basa en que los inventores han identificado y aislado una secuencia de nucleótidos novedosa correspondiente a la β-galactosidasa de Streptococcus mitis. Posteriormente, han creado dos métodos de expresión y purificación de β-galactosidasas modificadas: i) método de expresión y purificación de β-galactosidasa sin péptido señal y ii) método de expresión y purificación de β-galactosidasa con poli-histidinas.

La nueva proteína β-galactosidasa de S. mitis es una proteína consistente en 2.411 aminoácidos con un peso molecular aproximado de 268 kDa, presenta 5 motivos repetidos de unión a colina. Estas repeticiones son un rasgo característico de las proteínas de unión a colina de S. pneumoniae, lo que permite su purificación de manera sencilla a través de una columna cromatográfica de DEAE-celulosa... [Seguir leyendo]

Reivindicaciones:

1. Secuencia de nucleótidos caracterizada porque comprende una de las secuencias pertenecientes al siguiente grupo:

a) una secuencia de nucleótidos constituida por la secuencia de nucleótidos de la β-galactosidasa SEQ ID NO1,

b) una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia de a),

c) un fragmento de una cualquiera de las secuencias de a) y b).

d) una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia de a), b) y c).

2. Secuencia de nucleótidos según la reivindicación 1 caracterizada porque es la secuencia de la β-galactosidasa SEQ ID NO1.

3. Secuencia de nucleótidos según reivindicación 1 caracterizada porque la secuencia de nucléotidos de c) es un fragmento de la β-galactosidasa sin péptido señal (SEQ ID NO3).

4. Secuencia de nucleótidos según reivindicación 1 caracterizada porque es la secuencia SEQ ID NO5, que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO3 y una secuencia de nucleótidos codificante de seis histidinas en el extremo N-terminal de la SEQ ID NO3.

5. Secuencia de nucleótidos según reivindicaciones 1 a 4 caracterizada porque es una secuencia de ADN, ADNc o ARNm.

6. Construcción genética caracterizada porque comprende una secuencia de nucleótidos según reivindicaciones 1 a 5.

7. Vector de expresión caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótidos según reivindicaciones 1 a 6.

8. Vector de expresión según la reivindicación 7 caracterizado porque el vector de expresión es el plásmido pBSF01, pBSF02 o pHGM02.

9. Secuencia de aminoácidos caracterizada porque comprende una de las secuencias de aminoácidos pertenecientes al siguiente grupo:

a) una secuencia de aminoácidos constituida por la secuencia de aminoácidos de la β-galactosidasa de S. mitis (SEQ ID NO2),

b) una secuencia de aminoácidos análoga a la secuencia a),

c) un fragmento cualquiera de las secuencias de a) y b),

d) una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia cualquiera de a), b) y c).

10. Secuencia de aminoácidos según reivindicación 9 caracterizada porque es la secuencia de la β-galactosidasa SEQ ID NO2.

11. Secuencia de aminoácidos según reivindicación 9 caracterizada porque la secuencia de aminoácidos de c) es un fragmento de la β-galactosidasa sin péptido señal (SEQ ID NO4).

12. Secuencia de aminoácidos según reivindicación 9 caracterizada porque es la secuencia de la β-galactosidasa modificada SEQ ID NO6, que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO4 y una secuencia de seis histidinas en el extremo N-terminal de la SEQ ID NO4.

13. Uso de la secuencia de aminoácidos según reivindicaciones 9 a 12 en la reducción del contenido de lactosa en alimentos o residuos de procesos alimentarios pertenecientes, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, al siguiente grupo: productos lácteos y derivados, sueros de lechería.

14. Célula huésped, preferentemente procariota, caracterizada porque comprende una construcción genética según reivindicaciones 1 a 6.

15. Célula huésped, preferentemente procariota, caracterizada porque comprende el vector de expresión según reivindicaciones 7 a 8.

16. Célula huésped según reivindicaciones 14 y 15 caracterizada porque es una célula de Escherichia coli, preferentemente células E. coli MC4100.

17. Célula huésped según reivindicación 16 caracterizada porque es una célula de la cepa E. coli con el número de depósito CECT 7433 o E. coli con el número de depósito CECT 7434.

18. Uso de la célula huésped según reivindicaciones 14 a 17 en la reducción del contenido de lactosa en alimentos o residuos de procesos alimentarios pertenecientes, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, al siguiente grupo: productos lácteos y derivados, sueros de lechería.

19. Procedimiento de obtención de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO2 caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

a) obtención de una construcción genética que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO1, y del vector de expresión que comprende esta construcción genética,

b) transformación de una célula huésped, preferentemente de E. coli, en la que la construcción genética o el vector de expresión de a) bajo control de los promotores adecuados expresa la proteína codificada por la SEQ ID NO1, y purificación del extracto crudo de las células,

c) inmovilización de la proteína en matrices de DEAE-celulosa mediante el paso del extracto crudo de b) a través de la matriz,

d) disociación de la proteína de la matriz cromatográfica mediante lavado de la matriz con un medio que comprende colina,

y, opcionalmente e) posterior purificación de la proteína mediante el paso del eluído de d) a través de una matriz cromatográfica de exclusión por tamaño.

20. Procedimiento de obtención según reivindicación 19 caracterizado porque la secuencia de nucleótidos de a) es la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO3.

21. Procedimiento de obtención de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO6 caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

a) obtención de una construcción genética que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO5, y del vector de expresión que comprende esta construcción genética,

b) transformación de una célula huésped, preferentemente de E. coli, en la que la construcción genética o el vector de expresión de a) bajo control de los promotores adecuados expresa la proteína codificada por la SEQ ID NO5, y purificación del extracto crudo de las células,

c) inmovilización de la proteína en matrices de cromatografía de afinidad a iones metálicos inmovilizados mediante el paso del extracto crudo de b) a través de la matriz,

d) disociación de la proteína de la matriz cromatográfica mediante lavado de la matriz con un medio que comprende imidazol.

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