Medios de FFE y procedimientos de FFE que comprenden medios de separación volátiles.

Un procedimiento para analizar analitos que comprende:

a) una separación de los analitos mediante electroforesis de flujo libre (5 FFE) que comprende un medio deseparación acuoso para separar analitos mediante electroforesis de flujo libre que comprende al menos unácido tampón y al menos una base tampón,

en el cual cada uno de los ácidos tampón y cada una de las basestampón es volátil en condiciones de trabajo de espectroscopia de masas,

opcionalmente, en la cual el medio de separación se proporciona en forma de kit; y

b) un análisis posterior realizado aguas abajo de al menos un analito de interés obtenido de dicha etapa a) deseparación de FFE,

caracterizado por el hecho de que dicho análisis realizado aguas abajo es un análisis espectrométrico demasas seleccionado del grupo que consiste en ionización de electronebulización (ESI), desorción/ionizaciónpor láser en superficie (SELDI), desorción/ionización por láser asistida con matriz (MALDI o MALDI-TOFEM(/EM)) y CL-EM(/EM).

Medios de FFE y procedimientos de FFE que comprenden medios de separación volátiles

Campo de la invención La presente invención se refiere, en conjunto, al uso de medios de separación que comprenden un sistema tampón volátil en la electroforesis de flujo libre (Free Flow Electrophoresis, FFE) . Los medios de separación proporcionados en la presente memoria permiten realizar una separación conveniente de los analitos mediante electroforesis, y ofrecen la ventaja adicional de que los compuestos tampón y el disolvente se pueden eliminar fácilmente y sin dejar residuos mediante evaporación tras la etapa de separación electroforética. Más específicamente, en la presente invención, se proporcionan procedimientos para el análisis espectrométrico de masas de analitos que comprenden una etapa de separación de FFE en la que se emplean dichos medios de separación.

Antecedentes de la invención La electroforesis es una tecnología consolidada para separar partículas que se basa en la migración de partículas cargadas bajo la influencia de una corriente eléctrica directa. Se han desarrollado varios modos de funcionamiento diferentes, tales como el isoelectroenfoque (IsoElectric Focusing, IEF) , la electroforesis en zona (Zone Electrophoresis, ZE) y la isotacoforesis (IsoTachoPhoresis, ITP) , como alternativas del principio de separación anterior, y son comúnmente conocidas por los expertos en la materia.

El IEF es una técnica comúnmente empleada, por ejemplo, en la caracterización de proteínas como mecanismo para determinar el punto isoeléctrico de una proteína (véase “Analytical Biochemistr y ”, Addison Wesley Longman, tercera edición limitada, 1998) , mientras que la ZE se basa en la diferencia entre el valor de la movilidad electroforética de las partículas que se van a separar y de las especies cargadas del medio de separación empleado.

Los modos de funcionamiento generales previos se pueden aplicar a diferentes tecnologías electroforéticas tales como la electroforesis sobre un soporte sólido (por ejemplo, papel de filtro, acetato de celulosa, agarosa, etc.) , la electroforesis capilar y la electroforesis de flujo libre (FFE) .

Entre las tecnologías electroforéticas, la FFE es una de los más prometedoras [Krivanova L. y Bocek P. (1998) , "Continuous free-flow electrophoresis", Electrophoresis 19: 1064-1074]. La FFE es una tecnología en la cual la separación de los analitos se produce en un medio líquido en ausencia de una fase estacionaria (o un material de soporte sólido) para minimizar la pérdida de muestra por adsorción. La FFE a menudo se denomina electroforesis de deflexión sin portador o electroforesis de deflexión libre de matriz.

En el campo de la proteómica, la FFE es la tecnología seleccionada para la separación previa definida de muestras de proteínas complejas en términos de los valores variables de su punto isoeléctrico (pI) . Con el uso de la FFE, se pueden separar moléculas orgánicas e inorgánicas, biopartículas, biopolímeros y biomoléculas en base a su movilidad electroforética. Ya se han descrito los correspondientes principios [por ejemplo, Bondy B. et al. (1995) , "Sodium chloride in separation medium enhances cell compatibility of free-flow electrophoresis", Electrophoresis 16: 92-97].

Se ha mejorado el procedimiento de FFE, por ejemplo, mediante medios de estabilización y medios de flujo a contracorriente. Esto se refleja, por ejemplo, en la patente US 5.275.706. Según esta patente, se introduce un medio de flujo a contracorriente en el espacio de separación en contra de la dirección del flujo continuo del medio de separación neto y de la muestra que se desplaza entre los electrodos. Ambos medios (medios de separación y medios de flujo a contracorriente) se descargan o se eluyen por las salidas de fraccionamiento, comúnmente, a una placa de microtitulación, generando un procedimiento de fraccionamiento que tiene un bajo volumen hueco. Además, se mantiene un flujo laminar de los medios en la zona de las salidas de fraccionamiento (es decir, con una turbulencia muy baja o nula) .

Por ejemplo, en la patente US 6.328.868, se describe una técnica de FFE particular denominada FFE de intervalos. En esta patente, se introducen tanto la muestra como el medio de separación en una cámara de electroforesis, y se separan los analitos de la muestra mediante un modo electroforético tal como ZE, IEF o ITP y, finalmente, se expulsan de la cámara por las salidas de fraccionamiento. Realizaciones de la patente US 6.328.868 describen el movimiento de los medios de separación y la muestra como unidireccional, desplazándose desde el extremo de entrada hacia el extremo de salida de la cámara, con la aplicación de una tensión efectiva que hace que se produzca una migración electroforética, mientras que la muestra y los medios no se conducen hidráulicamente desde el extremo de entrada hacia el extremo de salida, en contraste con la técnica comúnmente usada en la materia, en la cual la muestra y los medios pasan a través del aparato mientras se separan en un campo eléctrico (FFE continua) .

El modo denominado cíclico o el modo cíclico en intervalos en el contexto de la FFE, como se usa en la presente memoria, se ha descrito en el documento WO 2008/025806. En resumen, el modo cíclico en intervalos se caracteriza por al menos una, y posiblemente, múltiples inversiones de la dirección del flujo neto global mientras que la muestra se mantiene en el campo electroforético entre los electrodos alargados. En contraste con el modo estático en intervalos, la muestra está en constante movimiento, permitiendo de ese modo una mayor intensidad de campo y, así, una mejor separación (o más rápida) . Además, mediante la inversión del flujo neto global de la muestra entre los electrodos alargados, se puede aumentar considerablemente el tiempo de residencia de los analitos en el campo eléctrico, ofreciendo de ese modo un mayor tiempo de separación y/o una mayor eficiencia de separación y mejor resolución. La inversión del flujo neto global en cualquier dirección paralela a los electrodos alargados (denominada un ciclo) se puede repetir tantas veces como sea necesario en una determinada situación, aunque las razones prácticas y el deseo de obtener una separación en un breve periodo de tiempo, normalmente, limitarán el número de ciclos llevados a cabo en este modo.

La solicitud de patente internacional WO 02/50524 describe un procedimiento de electroforesis en el que se emplea un aparato con una cámara de separación a través de la cual el medio de separación fluye y que proporciona un espacio de separación definido por un fondo y una cubierta, y espaciadores que separan estas dos partes entre sí. Además, este aparato de FFE comprende una bomba para suministrar el medio de separación, que entra en la cámara de separación a través de conductos de suministro del medio, y sale de la cámara por las salidas. El aparato de FFE también incluye electrodos para aplicar un campo eléctrico dentro del medio de separación y los puntos de inyección de muestra para la adición de la mezcla de partículas o analitos y los puntos de fraccionamiento para eliminar las partículas separadas mediante FFE en el medio de separación. Las partículas separadas se pueden usar para fines analíticos o para un procesamiento preparativo posterior. En cualquier caso, la solicitud no describe ningún medio de separación.

En la técnica, se conoce una serie de medios de separación para la separación de analitos tales como biopartículas y biopolímeros. Por ejemplo, en el libro "Free-flow Electrophoresis", publicado por K. Hannig y K. H. Heidrich (ISBN 3-921956-88-9) se publica una lista de medios de separación adecuados para la FFE y, en particular, para la ZE de flujo libre (FF-ZE) . La patente US 5.447.612 (Bier et al.) describe otro medio de separación que es un sistema tampón del pH para la separación de analitos por IEF mediante la formación de gradientes de zonas de pH reducidos funcionalmente estables previamente preparados. Emplea componentes de tamponamiento en pares tampón complementarios. Los componentes de tamponamiento se seleccionan entre determinados anfolitos químicamente puros, ácidos débiles y bases débiles, y se emparejan en base a sus características de disociación para proporcionar un gradiente de pH bastante bajo de entre 0, 4 a 1, 25 unidades de pH. Bier et al., “Electrophoresis”, Vol. 10 (10) (1989) , p. 690-697, informan sobre una variedad de separaciones de cromosomas mediante FFE, empleando, entre otros, TRIS/ácido acético como componentes de tamponamiento del medio de separación. Nath et al., “Biotechnology and Bioengineering”, Vol. 51 (1) (1996) , p. 15-22 también describen una... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para analizar analitos que comprende:

a) una separación de los analitos mediante electroforesis de flujo libre (FFE) que comprende un medio de separación acuoso para separar analitos mediante electroforesis de flujo libre que comprende al menos un ácido tampón y al menos una base tampón, en el cual cada uno de los ácidos tampón y cada una de las bases tampón es volátil en condiciones de trabajo de espectroscopia de masas, opcionalmente, en la cual el medio de separación se proporciona en forma de kit; y b) un análisis posterior realizado aguas abajo de al menos un analito de interés obtenido de dicha etapa a) de separación de FFE, caracterizado por el hecho de que dicho análisis realizado aguas abajo es un análisis espectrométrico de masas seleccionado del grupo que consiste en ionización de electronebulización (ESI) , desorción/ionización por láser en superficie (SELDI) , desorción/ionización por láser asistida con matriz (MALDI o MALDI-TOF-EM (/EM) ) y CL-EM (/EM) .

2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el medio es un medio binario que sólo comprende un ácido tampón y una base tampón; y, opcionalmente,

en el que el al menos un ácido tampón se selecciona del grupo que consiste en ácido fórmico, ácido acético, ácido picolínico, diacetilacetona, o-, m-y p-cresoles, o-, m-, p-clorofenoles, hidroxipiridinas, alcoholes fluorados y compuestos carbonílicos, tales como trifluoroetanol, tetrafluoropropanol, tetrafluoroacetona, y/o en el que la al menos una base tampón se selecciona del grupo que consiste en TRIS, hidroxipiridinas, amida del ácido isonicotínico, carbinoles de piridina, dietanolamina, bencilamina, piridinetanol y dimetilaminopropionitrilo.

3. El procedimiento según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el cual el medio de separación está sustancialmente libre de HPMC, urea, glicerol y/o PEGs.

4. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el cual la separación de los analitos mediante electroforesis de flujo libre se realiza en condiciones nativas.

5. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el cual al menos un medio de separación y/o una muestra comprende al menos un tensioactivo no iónico o zwiteriónico compatible con la EM; preferentemente, en el cual dicho al menos un tensioactivo no iónico compatible con la EM o zwiteriónico es un tensioactivo escindible.

6. El procedimiento según la reivindicación 5, en el cual al menos un tensioactivo o no iónico o zwiteriónico compatible con la EM es un tensioactivo escindible y en el cual un medio de flujo a contracorriente que comprende un agente de escisión se pone en contacto y/o se mezcla con una fracción que comprende un tensioactivo escindible y al menos parte de una muestra tras la separación electroforética; o

en el cual se usa un medio de flujo a contracorriente para estabilizar un tensioactivo escindible comprendido en al menos una fracción tras la separación electroforética de flujo libre,

y, opcionalmente, en el cual se elimina una porción de un tensioactivo escindible escindido mediante filtración, centrifugación o evaporación.

7. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el cual el procedimiento comprende:

formar entre los electrodos de un aparato adecuado para la electroforesis de flujo libre una zona de separación que comprende una zona A formada por al menos un medio tampón de separación (MTS) de tipo A, en la cual dicho MTS de tipo A es un medio de separación volátil según lo definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, y una zona B formada por al menos un medio tampón de separación de tipo B, en la cual el sistema tampón es un sistema tampón no volátil, entre un ánodo y un cátodo;

en la cual dicha zona A está situada en la zona de separación, de manera que al menos un analito de interés se puede eluir de la zona de separación en dicha zona A;

separar los analitos de una muestra introducida en dicho aparato adecuado para la electroforesis de flujo libre; y

eluir al menos un analito de interés de la zona de separación en un MTS de tipo A.

8. El procedimiento según la reivindicación 7, en el cual la muestra se introduce en dicho aparato en una zona A o en una zona B; y en el cual todos los analitos de interés se eluyen de la zona de separación en un MTS de tipo A; opcionalmente, en el cual dicho MTS de tipo A comprende al menos un tensioactivo no iónico compatible con la EM

o zwiteriónico y en el cual al menos un MTS de tipo B comprende un sistema tampón seleccionado entre anfolitos comerciales, un sistema binario de ácido tampón/base tampón (medio A/B) o un sistema tampón de múltiples pares complementarios (CMPBS) .

9. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el cual dicho procedimiento comprende las etapas de:

a) separar los analitos de una muestra introducida en un aparato adecuado para la electroforesis de flujo libre; b) eluir el/los analito/s obtenido/s a partir de la etapa de separación de FFE en una multiplicidad de fracciones; c) recoger al menos una fracción que contiene el/los analito/s que se va/n a analizar; y d) someter al menos una de las fracciones a dicho análisis realizado aguas abajo, en el cual dicha fracción no requiere una etapa de limpieza ni de purificación antes de dicho análisis de aguas abajo.

10. El procedimiento según la reivindicación 9, en el cual dicho análisis realizado aguas abajo es espectroscopia de masas de desorción/ionización por láser asistida por matriz (MALDI) y

i) en el cual se añade un componente matricial para el análisis de MALDI a la solución tampón de analitos recogida antes de realizar el análisis espectrométrico de masas; o ii) en el cual el medio de separación empleado en la etapa de separación de FFE comprende al menos un compuesto tampón que puede actuar como matriz para el análisis de MALDI y en el cual los compuestos tampón adicionales son volátiles en las condiciones de trabajo de la espectroscopia de masas de MALDI; o iii) en el cual se añade un componente matricial para el análisis de MALDI a la solución tampón de analitos recogida antes del análisis espectrométrico de masas y en el cual el medio de separación empleado en la etapa de separación de FFE comprende al menos un compuesto tampón que puede actuar como una matriz para el análisis de MALDI y en el cual los compuestos tampón adicionales son volátiles en las condiciones de trabajo de la espectroscopia de masas de MALDI.

11. El procedimiento según la reivindicación 9 o la reivindicación 10, que comprende además la etapa de añadir a al menos una fracción de la etapa de separación de EFL un agente para reducir el peso molecular de los analitos que se vayan a analizar mediante dicho análisis realizado aguas abajo; preferentemente,

en el cual el/los analito/s es/son fundamentalmente proteína/s o péptido/s, y en el cual el agente para reducir el peso molecular del/de los analito/s es una proteasa o una mezcla de proteasas; o en el cual el/los analito/s es/son nucleótido/s y en el cual el agente para reducir el peso molecular del/de los analito/s es una nucleasa o una mezcla de nucleasas.

12. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 que comprende además la etapa de eliminar al menos una parte del disolvente y de los compuestos tampón volátiles antes de dicho análisis de aguas abajo; preferentemente, en el cual la eliminación se realiza mediante centrifugación al vacío o mediante liofilización.

13. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en el cual dicho procedimiento se lleva a cabo sin una etapa de purificación para eliminar los tensioactivos o los restos de los tensioactivos escindibles escindidos seleccionada del grupo que consiste en diálisis, cromatografía, cromatografía de fase inversa, cromatografía de intercambio iónico, intercambio de tensioactivos, precipitación de proteínas, cromatografía de afinidad, electrotransferencia extracción en fase líquida-líquida, extracción en fase sólida-líquida y combinaciones de las mismas.

14. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, en el cual al menos un ácido tampón del medio de separación es ácido acético; o

en el cual al menos una base tampón del medio de separación es TRIS; o en el cual el medio de separación comprende un sistema tampón binario de ácido acético y TRIS; preferentemente,

en el cual las concentraciones de ácido acético y de TRIS se seleccionan individualmente de aproximadamente 1mM a aproximadamente 200mM, preferentemente, de aproximadamente 2mM a aproximadamente 100mM y, lo más preferentemente, de aproximadamente 5 a aproximadamente 50Mm.

15. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el cual los analitos que se van a separar mediante dicha etapa de FFE y se van a analizar mediante dicho análisis realizado aguas abajo son biopartículas, biopolímeros o biomoléculas; preferentemente en el cual las biopartículas, los biopolímero o las biomoléculas que se van a separar y analizar se seleccionan del grupo que consiste en proteínas, agregados de proteínas, péptidos, hormonas, complejos de ADN-proteína tales como la cromatina, ADN, anticuerpos, células, orgánulos celulares, virus o partículas de virus, membranas, fragmentos de membrana, lípidos, sacáridos, polisacáridos, liposomas, nanopartículas o mezclas de cualquiera de los anteriores.

16. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el cual la separación de los analitos se consigue mediante isoelectroenfoque de flujo libre (FF-IEF) , isotacoforesis de flujo libre (FF-ITP) o electroforesis de flujo libre en zona (FF-ZE) .

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias citadas por el solicitante es únicamente para la comodidad del lector. No forma parte del documento de la patente europea. A pesar del cuidado tenido en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO niega toda responsabilidad en este sentido.

Documentos de patentes citados en la descripción Literatura diferente de patentes citada en la descripción